Estudio epigenético en células de epidermis de raíz en Arabidopsis thaliana

• Autores: Beyrne, Cecilia Carmen
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Iusem, Norberto Daniel
• Materia: EPIGENÉTICA; METILACIÓN; ARABIDOPSIS; RAÍZ; EPIDERMIS; TRICOBLASTOS; ATRICOBLASTOS; EPIGENETIC; METHYLATION; ARABIDOPSIS; ROOT; EPIDERMIS; TRICHOBLASTS; ATRICHOBLASTS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las raíces de las plantas están conformadas por varios tejidos, siendo el más externo de ellos la epidermis, la cual se encuentra en contacto directo con el medio circundante. La epidermis se halla representada por una única capa de células, formada por tricoblastos y atricoblastos. Ambos tipos celulares se diferencian, principalmente, por ser solamente en los tricoblastos donde tiene lugar la formación del pelo radicular. El pelo radicular es una estructura de tipo proyección tubular que surge debido al crecimiento polarizado de una región de la célula, y es, entre otras cosas, el principal responsable de la absorción de agua y nutrientes del sustrato. Su distribución en la raíz no es azarosa, sino que resulta altamente regulada y conservada, observándose ciertos patrones de distribución típicos según la especie. La expresión génica en los organismos puede estar regulada por diversos mecanismos, entre ellos se encuentran los de orden epigenético, siendo un ejemplo de esta clase, la regulación por metilación/desmetilación de citosinas en el ADN. En el presente trabajo de tesis se abordó el estudio de patrones de metilación de citosinas en genes involucrados en el proceso de diferenciación celular en la epidermis de la raíz, y también de algunos que codifican para proteínas necesarias para la formación del pelo radicular, usando para ello Arabidopsis thaliana como modelo, y la técnica de bisulfito de sodio para los análisis de metilación. Se buscó comparar dichos resultados con los obtenidos en mutantes de genes clave durante los procesos antes mencionados, seleccionados por presentar un cambio drástico en cuanto a densidad o largo del pelo radicular, para lo cual se realizó previamente un análisis de fenotipo de varias líneas mutantes. Al realizar los ensayos se encontró que los genes Glabra2 (Gl2), Myb23 y Ttg1 mostraron presencia de metilación, mientras que Wer, Cpc, Ext10 y Rsl1 no lo hicieron. Se estudió también si el patrón de metilación de Gl2 se veía afectado como consecuencia de una perturbación ambiental, como ser la presencia de estrés salino al adicionarle al medio de crecimiento concentraciones medias y altas de cloruro de sodio, o si se modificaba debido a una perturbación genética, como ser la mutación del gen Wer, Cpc o Ttg1 (codificando los tres para proteínas que actúan río-arriba de GLABRA2 en la cascada proteica implicada en la determinación del destino celular en la epidermis). En ambos casos se observó una alteración del patrón epigenético, denotándose una ganancia en el nivel global de metilación de la región analizada en el caso de los mutantes, y una disminución del mismo en el caso del estrés salino. En el trabajo se evalúa y comprueba la herencia de nuevos niveles de metilación adquiridos como consecuencia del estrés salino, realizándose para ello el ensayo con raíces de plantas crecidas en un medio sin estrés, pero cuyos progenitores se habían enfrentado a él. Por último, se muestra la ejecución de variadas técnicas (1. Metodología INTACT, 2. Aislamiento nuclear seguido por INTACT, y 3. Obtención de protoplastos diferencialmente marcados, seguido por aislamiento mediante citometría de flujo) con el objetivo de abordar los estudios epigenéticos de manera específica de tipo celular, buscándose un análisis comparativo de los patrones de metilación en tricoblastos y atricoblastos. Aunque el resultado de estos ensayos no fue satisfactorio, se muestra también el desarrollo de una estrategia propia que posibilita aproximar los resultados a dicho objetivo, y se muestra su aplicación al trabajo de investigación presentado.
Several tissues form the roots of the plants, the epidermis being the more external of them and the one in contact with the surrounding medium. A single layer of cells, formed by trichoblasts and atrichoblasts, represents the epidermis. Both cell types differ, mainly, due to the fact that it is only in the trichoblasts that root hair formation occurs. The root hair is a tubular projection that arises as result of the polarized growth of a region of the cell, and is, among other things, the main responsible for the uptake of water and nutrients from the substrate. Its distribution in the root is not random, it is the result of a highly regulated and conserved process, finding some typical distributions according to the species. Gene expression is regulated by several mechanisms, among which are those of epigenetic order, being an example of them the regulation by methylation/demethylation of cytosines. The present work shows the study of the methylation pattern of cytosines on genes involved in the process of cell differentiation in the epidermis of the root, and of some genes that encode for proteins necessary for root hair formation, using Arabidopsis thaliana as a model, and the sodium bisulfite technique for the methylation analysis. It was sought to compare the results with those obtained with mutants of key genes in the processes mentioned above, which were selected because of showing a drastic alteration in density or length of root hair, having previously performed a phenotype analysis of several mutant lines. It was found that the genes Glabra2 (Gl2), Myb23 and Ttg1 showed methylation presence, while Wer, Cpc, Ext10 and Rsl1 did not. The methylation pattern of Gl2 under an environmental perturbation was also studied, as it is to grow under saline stress by the addition of high concentrations of sodium chloride to the growth medium. The same study was conducted under a genetic disturbance, as it is the mutation of the gene Wer, Cpc, or Etc1 (whose proteins acts up-stream GLABRA2 in the protein cascade involved in determination of cell fate in the epidermis). In both cases, an alteration of the epigenetic pattern was found, denoting a gain in the global methylation level of the analyzed region in the case of the mutants, and a decrease of it in the case of the saline stress. The work tested and proved the inheritance of new methylation levels acquired as a consequence of the presence of saline stress, having conducted the assays in this case with roots of plants grown without stress, but whose progenitors did it. Finally, the execution of a variety of techniques is shown (1. INTACT protocol, 2. Nuclear isolation follow by INTACT, and 3. Obtaining of protoplasts, in transgenic lines with differential marks, followed by the cell sorting technique) in order to perform the epigenetic studies in a cell-specific manner, looking for the comparative analysis of the methylation pattern of trichoblasts and atrichoblasts. Although the results of these assays were not satisfactory, a strategy that enables an approximation of the results to this objective is also shown, and its application to the experimental work presented here.
Fil: Beyrne, Cecilia Carmen. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.