Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae - Pautasso, María Constanza (2015)
Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiologíainterna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balanceinterno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad deperturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando deesta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructurascelulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a unainestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener lahomeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalizacióncomplejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en elambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez delambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichosmecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que estáninvolucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés ydiferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares escontrolada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consisteen un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por losgenes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un únicogen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa seencuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario,tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes decarbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación asituaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. Laespecificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por variosfactores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa ydel sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción dela quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. Laregulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo sebuscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de lassubunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificarglobalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en laregulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de losniveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de losgenes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menorde la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben unaactividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorionegativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propiosgenes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, ymediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía derespuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1,interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción ríoabajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y sureclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de larespuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó unmarcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismofermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas queparticipan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar alfactor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 comorepresor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activomediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores detranscripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado deglucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente decarbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducciónde señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente decarbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, serealizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevosreguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuentede carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías queregulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology paradeterminar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a lascategorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo defosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron tambiéngenes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por lospromotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió comoreguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cadasubunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos deinositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de lassubunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos defosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a suvez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad deuna regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estosprocesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además enrelación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulacióninhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de laexpresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega unrol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino deseñalización cAMP-PKA.