Análisis funcional y estructural de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA-8 y su rol en Escherichia coli recombinante - Mezzina, Mariela Paula (2014)
Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulosde polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de lacubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales yregulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicacionesbiotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidadfuncional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocosestudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado dela multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresadaen Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAzcrecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efectopromotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene uninesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condicionesnormales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento ymayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajodoctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina paraestudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce suefecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominioshidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, apesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de estaproteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que leconfieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datosexperimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado porinteracciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas característicasestructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estarrelacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividadchaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efectoprotector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de ladesnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraronque PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopíade fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localizaciónintracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB conel objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregadode proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizócon los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregadoscuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número decuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperonatanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinaspodrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estasobservaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevasaplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínasrecombinantes y otros productos heterólogos en E. coli.