Búsqueda de potenciales blancos para el diseño de drogas anti-parasitarias en dominios de interacción proteína-proteína y proteína-ARN en Trypanosoma cruzi

• Autores: Westergaard, Gastón Germán
• Año de publicación: 2011
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Vázquez, Martín Pablo
• Materia: CHAGAS; BLANCOS DE DROGAS; EXPRESION GENETICA; GENOMICA FUNCIONAL; CHAGAS; DRUG TARGETS; GENE EXPRESSION; FUNCTIONAL GENOMICS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En el presente trabajo encaramos la construcción de vectores destino Gateway®, pTREX-GW y pTREX-HGX-GW. Mediante el sistema de detecciones rápidas con fusiones a GFP exploramos una serie de mutantes Tcp14 para definir con exactitud las señales involucradas en su localización nuclear. De esta forma, pudimos determinar que Tcp14 no depende de su unión al factorSF3b155 para ingresar al núcleo, sino que posee una señal propia no descripta hasta ahora, que podría ser explotada como posible blanco de drogas. Otro modelo ambicioso de blanco de drogas son los dominios WW, módulos proteicos que median interacciones proteína-proteína reconociendo motivos peptídicos ricos en prolina. Un ejemplo promisorio entre las proteínas con WW son las TcZFPs. Se utilizó un vector inducible por tetraciclina para sobreexpresar TcZFP1b en las formas epimastigotes. Tras la inducción, los parásitos dejaron de dividirse después de 60 hs de la adición de tetraciclina y una extensa muerte celular se produjo después de 5 días. Las células se observaron como “monstruos” con múltiples flagelos y el contenido de ADN bloqueado en la citocinesis, provocando la muerte celular. Para analizar los cambios globales en la expresión génica, se llevo a cabo una pirosecuenciación de los ARNm en un Genome Sequencer FLX 454-Roche. Un grupo de 70 genes mostraron una regulación positiva mayor a 3 veces respecto al control, mientras que 35 genes mostraron una regulación negativa menor a 3 veces respecto el control. En general, se observó que varios ARNm de funciones relacionadas cambiaron de manera concertada como un patrón en respuesta post-transcripcional a la sobreexpresión de TcZFP1b, que parecería activar parte de un programa para diferenciar a los epimastigotes en tripomastigotes.
In this work we approach the construction of Gateway® destination vectors: pTREX-GW y pTREX-HGX-GW. Through the rapid detection system with GFP fusions we explored a series of Tcp14 mutants to define the precise signals involved in nuclear localization. Thus, we could determine that Tcp14 not depend on its binding factor SF3b155 to enter the nucleus, but has a non-descript, nuclear localization signal (NLS), which could be exploited as a potential target for drugs. Another ambitious model drug target are the WW domains, protein modules that mediate protein-protein interactions by recognizing proline-rich peptide motifs. A promising example between proteins with WW are TcZFPs. We used a tetracycline-inducible vector to overexpress TcZFP1b in epimastigotes. After induction, the parasites stopped dividing after 60 h of the addition of tetracycline and extensive cell death occurred after 5 days. The cells were seen as "monsters" with multiple flagella and DNA content in cytokinesis blocked, causing cell death. To analyze global changes in gene expression pyrosequencing of the mRNA was carried out in a Genome Sequencer FLX 454-Roche. A group of 70 genes showed an upregulation of more than 3 times compared to the control, while 35 genes showed a downregulation of less than 3 times compared to control. In general, we observed that several mRNA-related functions moved in concert as a pattern in post-transcriptional response to overexpression of TcZFP1b, which seems to activate part of a program to differentiate epimastigotes into trypomastigotes.
Fil: Westergaard, Gastón Germán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.