Análisis del microbioma de insectos : identificación y caracterización de glicosil hidrolasas - Ben Guerrero, Emiliano (2018)
Algunos insectos han desarrollado estrategias muy eficaces para utilizar sustratos lignocelulósicos como fuentes de energía. En termitas y algunos coleópteros, la digestión de la lignocelulosa es el resultado de la acción coordinada de enzimas endógenas y las de sus endosimbiontes junto con la digestión mecánica. Esta característica los convierte en un recurso óptimo para la búsqueda de nuevas enzimas lignocelulolíticas. En este contexto, el objetivo general de este trabajo consistió en el estudio y prospección de la diversidad bacteriana, cultivable y no cultivable, presente en el intestino de termitas nativas y coleópteros, así como la caracterización de enzimas hidrolíticas y su utilización en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. Por un lado, se exploró la diversidad bacteriana de los endosimbiontes celulolíticos cultivables y se evaluó la actividad (hemi) celulolítica de bacterias cultivables y de los extractos intestinales de dos termitas nativas argentinas, con hábitos alimenticios diferentes, Nasutitermes aquilinus (madera) y Cortaritermes fulviceps (suelo). Se obtuvo información acerca de la microbiota asociada con capacidad de degradar celulosa en cada termita. A su vez, mediante espectrometría de masas, se logró identificar varios péptidos, posiblemente involucrados en la degradación de hemicelulosa, con similitud a xilanasas. Al centrarnos en estas especies neotropicales menos estudiadas, intentamos descubrir nuevas fuentes biológicas de enzimas con posibles aplicaciones en biocombustibles. Además, se estudió de qué manera el microbioma del coleóptero Anthonomus grandis boheman responde a cambios en la dieta y cómo se modifican las actividades hidrolíticas en el intestino de larvas alimentadas con diferentes sustratos lignocelulósicas. Para ello, se alimentaron larvas de A. grandis con tres dietas artificiales diferentes: harina de algodón, pasto elefante y rastrojo de maíz. Mediante secuenciación de nueva generación (NGS) de la región hipervariable V3-V4 del gen de ARN ribosomal 16S, se estudiaron los cambios en la estructura y diversidad bacteriana del intestino del insecto. A partir de estos estudios se observó que los cambios producidos en la dieta influyen en la composición de la comunidad microbiana presente en el intestino, pudiéndose identificar un core microbiano entre las tres dietas. Estos resultados sugieren que los cambios en la abundancia de la microbiota degradadora de celulosa influyen sobre la actividad celulolítica general. A partir de datos provenientes del análisis metagenómico del intestino de la termita N. aquilinus, se seleccionaron seis genes codificantes para las enzimas glicosil hidrolasas más abundantes, pertenecientes a la familia 5. Dos de ellos, GH5CelA y GH5CelB, se expresaron en el sistema de Escherichia coli de manera soluble y las proteínas fueron purificadas a homogeneidad. Ambas enzimas presentaron actividad sobre los sustratos pNPC y β-glucano de cebada; GH5CelB mostró también actividad sobre Carboximetilcelulosa. La actividad enzimática óptima de ambas se detectó a temperaturas moderadas (entre 35 y 50 °C) y pH 5. Las enzimas mostraron diferencias en la cinética y el perfil de los productos de hidrólisis generados. Los resultados de esta tesis contribuyen a la caracterización de los procesos celulolíticos de los insectos y a la identificación y caracterización de enzimas degradadoras de celulosa con potencial aplicación en la industria del bioetanol y otros procesos biotecnológicos.