Identificación de marcadores genéticos asociados con la resistencia a la tuberculosis y la severidad de la enfermedad en Argentina - Rolandelli, Agustín (2017)
La tuberculosis (TB), enfermedad causada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continúa siendo un importante problema para la salud pública a pesar de la existencia de programas nacionales e internacionales de control de la enfermedad. Ha sido demostrado que los factores genéticos contribuyen al desarrollo de la TB, con una heredabilidad (proporción de la variación fenotípica en una población atribuible a componentes genéticos) estimada que oscila entre el 36% y el 70%. Identificar el rol de los factores genéticos en la resistencia/susceptibilidad a la TB podría contribuir al desarrollo de medidas preventivas y terapias genotípicas-específicas, optimizando la respuesta inmune frente a Mtb. El enfoque más ampliamente empleado para investigar la susceptibilidad genética a la TB es mediante estudios de asociación de genes candidatos. Los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) son la “marca genética de susceptibilidad” elegida en estudios de caso-control. Teniendo en cuenta la importancia de las citoquinas IL-17A e IFN-γ en la respuesta inmune frente a Mtb, en el presente trabajo de tesis se estudió la asociación de los SNPs rs2275913 (G→A) del gen de la IL-17A, rs1861494 (G→A) del gen del IFN-γ y rs763780 (T→C) del gen de la IL-17F (otra citoquina del perfil Th17, con alta similitud a la IL-17A) con la susceptibilidad a la TB y con la severidad de la enfermedad. La genotipificación de las poblaciones de pacientes con TB y de individuos sanos (DS) se realizó mediante la técnica de PCR alelo específica (ARMS-PCR). Se evaluó además el impacto que dichos polimorfismos podrían tener en la respuesta inmune del hospedador. Para esto, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de individuos portadores de las distintas variantes de los SNPs fueron estimuladas con un lisado de Mtb y se midieron diferentes parámetros inmunológicos. También se estudió la asociación con parámetros clínicos de severidad de la TB. Se demostró que el alelo A y el genotipo GA y AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A se encuentran sub-presentados en la población de pacientes con TB, indicando que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. Más aún, estimulando CMSP de DS con un lisado de Mtb, se detectó la mayor producción de IL-17A e IFN-γ en sobrenadantes de cultivo, los porcentajes más altos de células T CD4+ productoras de estas citoquinas, la mayor expresión del receptor SLAM y el índice de proliferación más alto en los individuos portadores del genotipo AA, en comparación con los individuos portadores del genotipo GG. Estos resultados indican que los DS portadores del genotipo AA montarían una respuesta inmune más efectiva frente a un primer contacto con la bacteria. Dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo A y el genotipo AA estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes bajos respondedores (BR), individuos con una respuesta inmune pobre contra Mtb. A su vez, se observó que las CMSP estimuladas de estos pacientes presentaban los mayores niveles de IL-17A y los menores de IFN-γ secretados en sobrenadantes de cultivos, el mayor porcentaje de células T CD4+ productoras de IL-17A, la menor expresión de SLAM en sus linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en comparación con los pacientes portadores del genotipo GG, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. De hecho, se encontró una asociación entre los pacientes portadores del genotipo AA y parámetros clínicos de mayor severidad de la TB (mayor número de bacilos en esputo y las lesiones radiológicas de pulmón más severas). Así, se propone al genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A como un marcador de resistencia a la TB y de mayor severidad de la enfermedad en Argentina. El estudio caso-control realizado para analizar la asociación entre el SNP rs1861494 del gen del IFN-γ y la TB reveló que el alelo A y el genotipo AA se encuentran sub-representados en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de resistencia a la TB. De hecho, se encontró que las CMSP estimuladas con un lisado de Mtb de DS portadores del genotipo AA secretaban los mayores niveles de IFN-γ y tenían los porcentajes más altos de linfocitos T CD4+ productores de esta citoquina, crucial en la respuesta inmune del hospedador contra la bacteria. Sin embargo, dentro de la población de pacientes con TB no se observaron diferencias en ninguno de los parámetros inmunológicos medidos entre pacientes portadores de las distintas variantes del SNP. Tampoco se evidenció asociación entre el SNP y parámetros clínicos de severidad de la enfermedad. Así, se propone al alelo A y al genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN-γ como marcadores de resistencia a la TB, sin relación con la severidad de la enfermedad en Argentina. Por último, se estudió la relación entre el SNP rs763780 del gen de la IL-17F y la TB. Se encontró al alelo C y a los individuos portadores de este alelo (TC/CC) sobre-representados en la población de pacientes con TB, sugiriendo que este SNP podría ser considerado como un marcador de susceptibilidad a la TB. En concordancia con estos resultados, se observó que las CMSP estimuladas de DS portadores del alelo C presentaban el menor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFN-γ , la menor expresión de SLAM en linfocitos T CD3+ y el menor índice de proliferación en respuesta al lisado de Mtb, indicado que estos individuos montarían una respuesta inmune más pobre frente a un primer contacto con la bacteria. Interesantemente, se observó una mayor secreción de IL-17F por parte de CMSP estimuladas de DS en comparación con los pacientes con TB, sin encontrarse diferencias entre los individuos portadores de las distintas variantes del SNP. Más aún, se detectaron los menores niveles de IL-17F en pacientes BR, sugiriendo que esta citoquina cumpliría un rol en la respuesta inmune generada contra Mtb. Además, dentro de la población de pacientes con TB, se identificó que el alelo C y los individuos portadores de este alelo estaban sobre-representados en la sub-población de pacientes BR. También, se detectaron los menores niveles de IFN-γ y los mayores de IL-17A en sobrenadantes de cultivo, el mayor porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IL-17A y el menor índice de proliferación en las CMSP estimuladas de pacientes portadores del alelo C en comparación con los pacientes TT, parámetros inmunológicos asociados con mayor severidad de la TB. Asimismo, se evidenció que la mayoría de los pacientes portadores del alelo C presentaban un mayor número de bacilos en esputo en relación con los pacientes TT. Por esto, se propone al alelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17F como un marcador de susceptibilidad y de mayor severidad de la TB en Argentina. En conclusión, la identificación del genotipo AA del SNP rs2275913 del gen de la IL-17A y del genotipo AA del SNP rs1861494 del gen del IFN-γ como marcadores de resistencia a la TB; del alelo C del SNP rs763780 del gen de la IL-17F como un marcador de susceptibilidad a la TB; y el rol demostrado de estas citoquinas en la inmunología de la enfermedad podrían contribuir al diseño de vacunas más efectivas y a identificar sub-poblaciones de riesgo a contraer la enfermedad en Argentina. Además, la asociación del genotipo AA del SNP rs2275913 y del alelo C del SNP rs763780 con una mayor severidad de la TB en los pacientes de Argentina podría utilizarse en la implementación de estrategias de tratamiento paciente-específica.