Síntesis, caracterización y aplicaciones de dnazimas modificadas con 2´-desoxi-2´-c-metilnucleósidos - Robaldo, Laura (2011)
Las enzimas de ADN (DNAzimas) son moléculas catalíticas formadas por una cadena simple de desoxirribonucleótidos. Estas moléculas no se encontraron en la naturaleza sino que fueron obtenidas a través de procesos de selección molecular in vitro. En particular, la DNAzima 10-23 es una enzima de ADN que fue descripta por Santoro y Joyce en 1997. Es la más utilizada en estudios de silenciamiento génico en sistemas biológicos debido a su capacidad de reconocer, unirse e hidrolizar una molécula de ARNm. Su secuencia se compone de un núcleo catalítico conservado de 15 desoxirribonucleótidos y dos brazos de reconocimiento a ambos lados del núcleo. Luego de unirse por complementariedad de bases, la DNAzima 10-23 puede hidrolizar al ARNm blanco entre una purina desapareada (A, G) y una pirimidina apareada (U, C) en presencia de Mg2+. La estabilidad de una DNAzima se puede mejorar mediante la incorporación de nucleósidos modificados tanto en el núcleo catalítico como en los brazos de reconocimiento. Estas modificaciones pueden aumentar la estabilidad y prolongar la vida media de la DNAzima en sistemas biológicos. Por otro lado, el uso de modificaciones químicas permite estudiar y resolver interrogantes respecto a la relación entre la estructura y la función de estas moléculas. Esta tesis consiste en la síntesis y caracterización de DNAzimas modificadas en el núcleo catalítico con (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C-metilnucleósidos. Estos nucleósidos presentan una restricción de la conformación del anillo furanósico dependiendo de la configuración del carbono 2 ́. Por otra parte, al incluir estas modificaciones en secuencias de oligonucleótidos, se ve aumentada la estabilidad ante la degradación por nucleasas. El objetivo principal fue obtener DNAzimas resistentes a la degradación nucleolítica que pudieran ser útiles en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos. Por otra parte, se analizaron las consecuencias funcionales y estructurales generadas por la incorporación de estas modificaciones a la estructura de la DNAzima 10-23. Los resultados obtenidos muestran que las modificaciones (2'R) y (2'S)-2'-desoxi-2'-C- metilnucleósidos pueden ser estratégicamente introducidas en diferentes posiciones del núcleo catalítico de la DNAzima 10-23 sin observarse una pérdida significativa de la actividad. También se observó que estas modificaciones aumentan la vida media de las DNAzimas en diferentes sistemas biológicos. En base a estos resultados, podemos concluir que las DNAzimas sintetizadas en este trabajo podrían ser útiles como molécula antisentido en la inhibición de la expresión de ARNms terapéuticos.