Estudio de las extensinas específicas de polen (LRXs) involucradas en el crecimiento polarizado de tubos polínicos en Arabidopsis thaliana - Sede, Ana Rocío (2019)
El crecimiento celular polarizado de los tubos polínicos es un proceso oscilatorio que implica una compleja regulación de iones Ca2+, especies reactivas de oxígeno (EROs) y alto tráfico vesicular hacia la zona apical. Durante este proceso ocurre la constante remodelación de la pared celular, la cual debe ser rígida para soportar las presiones citoplasmáticas laterales de turgencia pero a la vez flexible en la zona apical para posibilitar el crecimiento. Para esto, es crucial que el ensamblado de la pared celular se encuentre estrictamente regulado mediante la construcción de una red flexible generada por el entrecruzamiento entre glicoproteínas específicas y homogalacturonanos presentes en el espacio apoplástico. En angiospermas, las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs) constituyen una de las familias más abundantes de proteínas estructurales que mayor número de modificaciones post-traduccionales sufre. Miembros de esta familia son las extensinas (EXTs), los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) y las proteínas repetitivas en prolina (PRPs). Dentro de las EXTs, se encuentra la subfamilia de las proteínas LRXs (Leucine-rich repeat extensins) constituida por 11 miembros, de los cuales 4 (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11), se expresan específicamente en polen maduro y tubo polínico. Dichas proteínas, presentan una estructura modular formada por un dominio N-terminal rico en repeticiones de leucina (LRR) y un dominio C-terminal de tipo extensina plausible de ser glicosilado. En este trabajo de tesis, caracterizamos y estudiamos la función de las proteínas LRXs de polen (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11). Mediante ensayos fisiológicos se demostró que la ausencia de las proteínas LRX8-LRX11, afecta la germinación de los granos de polen, ocasiona alteraciones en la integridad de los tubos polínicos y provoca desviaciones en la herencia mendeliana. Así mismo, se observó mediante microscopía confocal, que la mutante triple pérdida de función lrx9 lrx10 lrx11 presenta fallas en el ensamblado de la pared celular, tales como la deposición alterada de los polisacáridos más abundantes, calosa y pectina. Las evidencias obtenidas sugieren que las proteínas LRX8-LRX11 son necesarias para el mantenimiento de la integridad de la pared celular de los tubos polínicos durante el crecimiento celular polarizado. El motivo EXT presente en las HRGPs se caracteriza por poseer numerosas repeticiones de la secuencia Ser(Pro)3-5. Previo a ser secretadas a la pared celular, es necesario que ocurran tres modificaciones post-traduccionales (MPTs): la monogalactosilación de los residuos serina (Ser) (N-glicosilación), la hidroxilación de los residuos prolina (Pro) a hidroxiprolina (Hyp) y la posterior O-glicosilación de la Hyp. Las enzimas responsables de catalizar la hidroxilación de Pro son las prolil-4-hidroxilasas (P4Hs). Es por ello que estudiamos el rol de las proteínas P4H4 y P4H6, de alta expresión en polen, y la importancia de la hidroxilación de las HRGPs. Los resultados obtenidos mostraron que las mutantes simples p4h4, p4h6 y la mutante doble p4h4 p4h6, presentan una disminución en la tasa de germinación de los granos de polen. Resultados similares se obtuvieron al bloquear la acción de las enzimas P4Hs empleando los inhibidores químicos EDHB (etil-3,4-dihidroxibenzoato) y DP (α,α-dipiridil). Si bien se observó una reducción en el largo de los tubos polínicos de la mutante doble p4h4 p4h6, la disposición y el contenido de pectina en la pared celular de tubos polínicos mutantes fue similar al de plantas wild type. Finalmente, se determinó la posible localización subcelular de la enzima P4H4 en el retículo endoplasmático (RE)/aparato de Golgi en tubos polínicos de plantas transgénicas expresando la construcción pP4H4::P4H4-YFP. En base a lo observado, proponemos que la hidroxilación de las HRGPs, y posiblemente de las LRXs, sería catalizada por las P4Hs en el RE/aparato de Golgi y sería necesaria principalmente durante los primeros estadíos del desarrollo del tubo polínico. Sin embargo, se requerirán nuevos estudios para determinar si, además de P4H4 y P4H6, existe otra enzima de la familia P4H implicada en la hidroxilación de las HRGPs, particularmente las LRX de polen.