Regulación del transporte paracelular de sodio en la rama gruesa ascendente del Asa de Henle por óxido nítrico - Monzón, Casandra Margarita (2017)
La rama gruesa ascendente del asa de Henle reabsorbe el 30% del cloruro de sodio (NaCl) filtrado por el glomérulo. Aproximadamente 60% del ión sodio (Na+) es reabsorbido a través del transporte activo transcelular. Como resultado del transporte activo de solutos, existe un voltaje luminal positivo en esta segmento, que favorece la reabsorción del Na+ restante a través de la vía paracelular. El óxido nítrico (NO) promueve natriuresis y diuresis, en parte debido a la inhibición del transporte de solutos en la rama gruesa ascendente del asa de Henle. Se sabe que el NO inhibe la reabsorción transcelular de sal, pero se desconocen sus efectos sobre la vía paracelular. Para evaluar el efecto del NO en la selectividad de esta última, comenzamos por medir los potenciales de dilución causados por la reducción de la concentración de NaCl en la solución del baño basolateral a 64/56, 32/24 ó 16/8 mM Na+/Cl- en túbulos de la rama gruesa ascendente del asa de Henle aislados y perfundidos. A partir de los diferentes potenciales de dilución calculamos el radio de permeabilidad Na+/Cl- (PNa+/PCl-). Dicho radio es una medida de permeselectividad paracelular, y encontramos que era ~2 en todos los casos. Estos datos indican que la vía paracelular en este segmento del nefrón es más selectiva para Na+ que para el ión cloro (Cl-) por un factor de 2, e indican que el transporte transcelular no se alteró de manera significativa por la dilución de NaCl en el baño basolateral. En los experimentos siguientes empleamos la solución conteniendo 32/24 mM de Na+/Cl-. Al utilizar dos dadores de NO químicamente distintos o el sustrato para la producción endógena de NO, L-arginina, se observó una disminución de PNa+/PCl-. Estos resultados demuestran que NO tiene un efecto sobre la selectividad de la vía paracelular, pero no indican específicamente cómo las permeabilidades absolutas de cada ión se ven afectadas. Para investigar el efecto del NO sobre PNa+ y PCl- individualmente, es necesario medir tanto PNa+/PCl- como la resistencia transepitelial (Rt). La Rt refleja solamente las vías de transporte conductivas y, en la rama gruesa ascendente del asa de Henle, representa mayormente la resistencia de la ruta paracelular. Bajo condiciones control, el valor de Rt hallado fue 7700 ohm-cm. Cuando se agregó L-arginina, la Rt disminuyó, y dicho efecto fue bloqueado por el inhibidor de NOS, L-NAME. Estos resultados demuestran que el NO disminuye la función de “barrera” de la ruta paracelular. A continuación medimos una vez más el efecto del NO producido de manera endógena sobre los potenciales de dilución y PNa+/PCl-. Con estos datos y los valores de Rt obtenidos, calculamos PNa+ y PCl- individualmente, hallando que el NO incrementó PNa+ un 40% y PCl- un ~100%. La mayoría de las acciones del NO en el túbulo proximal y la rama gruesa ascendente del asa de Henle están mediadas por guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Es por esto que investigamos si este segundo mensajero está mediando los efectos del NO sobre la vía paracelular observados en nuestro modelo. El GMPc disminuyó PNa+/PCl- y Rt, provocando el aumento de PNa+ y PCl- de manera similar al NO. Estos datos sugieren que GMPc está mediando el efecto final del NO sobre las permeabilidades absolutas. El GMPc puede activar dos mediadores posteriores en la vía de señalización, la proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG) y la fosfodiesterasa 2 (PDE2). Por lo tanto, evaluamos cuál de ellos está mediando las acciones del NO. En presencia del inhibidor de PKG, KT5823, el dador de NO no tuvo efecto significativo sobre el potencial de dilución. En contraste, cuando repetimos este experimento utilizando un inhibidor de PDE2, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución, de manera similar a lo descripto anteriormente para aquellos experimentos donde solamente utilizamos un dador de NO. Estos datos indican que PKG, y no PDE2, es el mediador del efecto del NO sobre la ruta de transporte paracelular. La Rt y la selectividad iónica de la vía paracelular están reguladas por una familia de proteínas llamadas claudinas. La rama gruesa ascendente del asa de Henle expresa claudina-19, que ha sido anteriormente relacionada con la regulación de la permeabilidad de Na+. Además, la claudina-19 puede formar combinaciones heteroméricas y heterotípicas con las claudinas-3 y -16 en este segmento. Para evaluar si los efectos de NO sobre la vía paracelular están mediados por un poro del cual al menos la claudina-19 forma parte, medimos los potenciales de dilución en presencia o ausencia de un anticuerpo contra un dominio extracellular de la claudina-19 o contra la proteína Tamm-Horsfall (control). Cuando el anticuerpo anti-claudina-19 estaba presente, ni el dador de NO, ni el sustrato para la producción endógena de NO -L-arginina- tuvieron efecto sobre los potenciales de dilución. En presencia del anticuerpo anti-Tamm-Horsfall, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución. Estos datos sugieren que los efectos del NO sobre la vía paracelular son mediados por un poro formado al menos por una unidad de la claudina-19. Finalmente, modelamos matemáticamente el efecto del NO sobre la concentración luminal de Na+ a lo largo de la rama gruesa ascendente del asa de Henle basándonos en nuestros resultados. Bajo condiciones control, en ausencia de NO, la concentración luminal de Na+ decae exponencialmente a 22.4 mM al final de dicho segmento. Cuando consideramos el efecto del NO sobre la vía paracelular únicamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 33.9 mM, más alta que en control, indicando que se absorbe menos Na+. Al tener en cuenta el efecto del NO sobre la vía transcelular solamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 46.2 mM, y al considerar su efecto sobre ambas vías combinadas, 52.5 mM. Por lo tanto, el efecto del NO sobre la ruta paracelular provoca una reducción en la reabsorción neta de Na+. La magnitud de dicha reducción es similar a aquella resultante de NO actuando sobre la ruta transcelular, pero el efecto del NO sobre ambas vías combinadas tiene una dinámica de antagonismo.