Rol de la Guanilil Ciclasa y el GMPc en el metabolismo de la tiroides - Bocanera, Laura Viviana (1996)
El presente trabajo de tesis tienen como objetivo estudiar el rol en la glándula tiroides de la enzima guanilato ciclasa (GC) y el producto de la reacción catalizada por esta: el GMPc. En la primera sección se detalla la caracterización parcial de la enzima en tiroides bovinas. Los resultados obtenidos, demuestran la presencia de dos tipos de GC: una soluble y una particulada, predominando la actividad soluble (79%) sobre la actividad asociada a membrana (8%). El tratamiento con Tritón X-100 incrementa la actividad de ambas enzimas (350% GC particulada, 70% GC soluble). Con el objeto de descartar cualquier posible contaminación de la fracción soluble con la fracción particulada y viceversa, se determinó las actividades de las enzimas en ambos preparados, previamente tratados con activadores específicos para cada una de ellas: Pépitido natriurético atrial (ANP) para la GC particulada y nitroprusiato de sodio (NP) para la GC soluble. El ANP incrementó la actividad en la fracción de membrana y el NP activó la GC de la fracción soluble, sin observarse ningún efecto del ANP y NP sobre la enzima soluble y particulada respectivamente, descartando una contaminación de las fracciones entre si. Para estudiar el grado de interacción entre la enzima particulada y la membrana, se sometió al precipitado de la centrifugación de 105.000 x g a tratamientos con NaCl 0.5 mM, deoxicolato 1%, o Lubrol PX 1%, obteniéndose mayor actividad en las muestras tratadas con Lubrol PX indicando que la proteína se encuentra fuertemente asociada a la membrana. Cuando se estudió el comportamiento cinético considerando el complejo MnGTP como sustrato, la cinética fue michaelina para la GC soluble con un Km de 0.036 mM, mientras que la enzima particulada mostró un comportamiento alostérico positivo con un S0.5 de 0.230 mM y un coeficiente de Hill de 1.9, indicando que existen en la enzima, por lo menos dos sitios de unión para el sustrato. Con el objeto de estudiar el efecto de diferentes concentraciones de manganeso, se determinó la actividad enzimática trabajando en condiciones de exceso de Mn2+ respecto de la concentración de GTP. Los resultados obtenidos en esta serie de experimentos, muestra un comportamiento alostérico positivo para la enzima soluble con un S0.5 de 1.2 mM y un coeficiente de Hill de 2.9. La cinética para la enzima particulada ensayada en las misma condiciones, resultó michaeliana con un Km de 0.280 mM. Si bien la actividad enzimática es altamente dependiente de manganeso, resultó de interés investigar el efecto sobre la enzima de otros cationes divalentes: Mg2+ y Ca2+. Reemplazando el Mn2+ por Mg2+ en el medio de reacción, no se observó actividad de la enzima asociada a la fracción particulada, obteniéndose con la enzima particulada, sólo un 15% de la actividad determinada en presencia de manganeso. El calcio en ausencia o presencia de concentraciones óptimas de manganeso, no tuvo efecto sobre la actividad de ninguno de los dos tipos de GC. Con concentraciones subóptimas de Mn2+, se observó un aumento de la actividad en la GC soluble a altas concentraciones de calcio. Este este estímulo sólo representa aproximadamente el 20% de los valores obtenidos con concentraciones de manganeso óptimas. Con la GC particulada en las mismas condiciones experimentales se observó una ligera pero significativa inhibición a concentraciones altas de Ca2+. La segunda parte de este trabajo está dedicada a determinar el posible rol biológico asociado a la GC soluble en la glándula tiroides. Para este fin se utilizó como modelo experimental cultivos primarios de tiroides bovinas. La primera serie de experimentos tuvo como objetivo verificar que en el modelo experimental utilizado, la GC soluble es activable por el nitroprusiato de sodio (NP). Los resultados obtenidos indican que el NP produce un incremento en la actividad enzimática que es dependiente de la y del tiempo de tratamiento, incrementando correlativamente los niveles de GMPc. Dado que el transporte de ioduro, constituye el paso inicial y limitante en la síntesis de las hormonas tiroideas, se estudió el efecto del NP sobre la incorporación del halógeno. Se observó una inhibición significativa de la capitación de yoduro a las 2 hs de tratamiento con 5 mM de NP en células previamente tratadas con TSH por 72 hs, sin variaciones sobre los basales (células sin TSH). Este efecto fue reproducido por un análogo del GMPc (8Br-GMPc), y bloqueado por hemoglobina reducida, sugiriendo que este se encuentre mediado por la vía GC-GMPc. La inhibición producida por el NP fue también observada cuando las células son tratadas con activadores del sistema adenilil ciclasa-AMPc tales como forskolina y análogos del AMPc, indicando que el compuesto nitrogenado podría estar inhibiendo un efecto de la TSH desencadenado a través de este sistema de transducción de señales. Sin embargo, el punto de acción sería distal a la formación de AMPc, dado que los niveles del nucleótido no se encuentra disminuidos. Dado que la incorporación de iodo a la célula tiroidea se encuentra determinada por un equilibrio entre la entrada y la salida o eflujo, se consideró de ínterés evaluar que mecanismo se encontraba afectado por el NP. En una primera instancia se estudió el efecto del compuesto nitrogenado sobre la salida o eflujo de iodo, no observándose diferencias significativas en las células tratadas con NP respecto al control. Teniendo en cuenta que la incorporación de yoduro en la célula tiroidea se encuentra inequivocamente ligada a la actividad de la ATPasa Na+/K+ estimulable, se investigó la acción del NP sobre esta enzima. Los resultados obtenidos indicaron una marcada inhibición en la actividad de la enzima en células previamente tratadas con TSH por 72 hs sin efectos significativos sobre los cultivos en condiciones basales. Este efecto es reproducido por 8Br-GMPc confirmando que la inhibición se encuentra mediada por el sistema GC-GMPc.