Estudio de la relación entre transcripción y Splicing alternativo de mRNAs eucarióticos - Cramer, Paula (1999)
En el presente trabajo de tesis nos hemos propuesto buscar evidencias sobre la coordinación entre los procesos de transcripción y splicing alternativo. Nuestro modelo de estudio consistió en construir una batería de minigenes α-globina/ fibronectina que incluyen al exón EDI de la fibronectina capaz de sufrir splicing alternativo, clonados río abajo de diferentes promotores. Con estos minigenes se transfectaron líneas celulares en cultivo, analizándose luego el patrón de splicing alternativo por medio de las técnicas de Northern blot y/o RTPCR. Encontramos así que el tipo de promotor determina el patrón de splicing alternativo. Este efecto del promotor sobre el splicing alternativo no depende de la fuerza del promotor ni de la secuencia de la región 5' no codificante de los mRNAs, sino de la calidad de factores de transcripción reclutados en el promotor. Posteriormente intentamos dilucidar el mecanismo subyacente a este fenómeno. Para ello sobreexpresamos proteínas que participan del splicing general y/o alternativo en otros modelos. Encontramos que sólo las proteínas SF2/ASF, SRp40, SRp55 y SC-35 son capaces de modificar el patrón de inclusión de EDI, mientras que las proteínas SRp20, SRp30c y Tra2βno tienen efecto alguno. El efecto de SF2/ASF, la proteína con mayor actividad estimulatoria, es específico de promotor y opera a través de las secuencias regulatorias en cis presentes en EDI, tal como lo demuestran los experimentos con minigenes mutantes en estas regiones. Los resultados mencionados constituyen la primera evidencia de coordinación entre transcripción y splicing alternativo. A partir de los mismos proponemos un modelo de interacción entre el dominio carboxiterminal (CTD ) de la RNA polimerasa II y los factores de splicing, compatible con los resultados observados en nuestro laboratorio y en otros grupos de investigación.