Regulación de linfocitos T CD8+ mediada por IL-10 en la enfermedad de Chagas experimental

• Autores: Miranda, Cristian Gabriel
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Alba Soto, Catalina Dirney
• Materia: TRYPANOSOMA CRUZI; INTERLEUQUINA 10 (IL-10); MENOR RESISTENCIA; LINFOCITOS T CD8+; INMUNOESTIMULACION; TRYPANOSOMA CRUZI; INTERLEUKIN 10 (IL-10); LOWER RESISTANCE; CD8+ T LYMPHOCYTES; IMMUNOSTIMULATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El objetivo de este trabajo de tesis consistió en estudiar el papel de la interleuquina 10 (IL-10) sobre distintos mecanismos que regulan la homeostasis de los linfocitos T CD8+ (LT CD8+) durante la infección producida por el parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Para ello, contamos con un modelo de infección experimental con T. cruzi en ratones deficientes para el gen de la IL-10 (IL-10 KO) de background Balb/c. En este modelo encontramos que, a pesar de ser la IL-10 considerada como una citoquina inmunomoduladora, en su ausencia el repertorio de LT CD8+ presentaba deficiencias en su expansión y activación funcional en respuesta a la infección con el parásito. El estudio de la cinética de los LT CD8+ en el bazo de ratones infectados reveló que el defecto en la expansión en el grupo IL-10 KO se aprecia desde la etapa aguda de la infección (21 dpi), y se correlaciona con una apoptosis temprana (7 dpi) que resultó ser específica de esta población celular y no de linfocitos T CD4+. A su vez, encontramos que la expresión de FasL, que se incrementa en los LT CD8+ activados, se encontraba disminuida en el grupo IL-10 KO a 21 dpi. Evaluamos la función efectora de LT CD8+, analizando simultáneamente su expresión de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IFN-γ) y potencial citotóxico (expresión de CD107a en membrana plasmática). La función efectora resultó ser significativamente menor en los LT CD8+ de ratones IL-10 KO infectados. A su vez, el análisis de polifuncionalidad no reveló diferencias en el perfil de esta población linfocitaria relacionadas con la ausencia de IL-10 durante la infección. En concordancia con esto, la capacidad citotóxica in vivo específica contra un epitope de transialidasa de T. cruzi (TSKD14) fue significativamente menor en los LT CD8+ del grupo IL-10 KO indicando que el defecto en la inducción de la función efectora de LT CD8+ totales también se trasladaba a la fracción T. cruzi específica. La menor función efectora de los LT CD8+ en ausencia de IL-10 se asoció a un aumento significativo en la expresión de los marcadores inhibitorios (PD-1, CTLA-4 y LAG-3) y una reducción significativa en la expresión del marcador de activación T-bet. Esta población exhibiría un fenotipo prematuramente agotado en respuesta al estímulo antigénico a través de TCR. Al disminuir la carga parasitaria (y en consecuencia el constante estímulo via TCR) en ratones infectados con T. cruzi tratados con la droga parasiticida Benznidazol, se redujo la expresión del marcador inhibitorio PD-1 en los LT CD8+ IL-10 KO. A su vez, el tratamiento ex vivo de esplenocitos totales de ratones infectados con IL-10 recombinante no logró rescatar los LT CD8+ del fenotipo agotado pero resultó en una reducción de la expresión de PD-1 en ratones KO y WT lo que sugiere que las vías de señalización por PD1-L e IL-10R podrían tener mecanismos compensatorios. La presencia de IL-10 en el microambiente de tejidos linfoides y periféricos también participa en eventos que conducen al “homing” de linfocitos hacia los tejidos blanco de la infección por T. cruzi. La ausencia de IL-10 produce una mayor inflamación de los tejidos sin embargo se observa una menor migración de esplenocitos totales hacia órganos blanco de daño. En ensayos de migración observamos una migración diferencial de LT CD8+ según el órgano analizado. Los linfocitos citotóxicos provenientes de ratones IL-10 KO migran en menor cuantía a corazón que los WT y lo opuesto se observa en el cuádriceps. Esto se correlaciona con un menor control de la carga parasitaria en el primer órgano que en el segundo. Cuando analizamos las quemoquinas producidas en cuádriceps y corazón de ratones infectados encontramos que CXCL9 y CXCL10 están sobreexpresadas en ambos órganos en ratones IL-10 KO lo cual se condice con la mayor inflamación de estos con respecto a los WT. Pero cuando analizamos CCL5 (cuyo receptor CCR5 se encuentra significativamente sobreexpresado en LT CD8+ esplénicos de ratones IL-10 KO) encontramos que la ausencia de IL-10 estimula su expresión en cuádriceps, respecto del WT, pero no en corazón. Esto coincide con la migración de LT CD8+ y control parasitario diferencial en los distintos órganos. De estos resultados concluimos que la migración de LT CD8+ esplénicos cumple un papel importante en el control de T. cruzi en los órganos infectados y que existe esta migración diferencial a órganos orquestada por diferencias regionales en la expresión de CCL5 y participación de IL-10. Futuros experimentos nos permitirán entender la relación de CCL5 en la migración diferencial a órganos de esta población linfocitaria. En conjunto, estos resultados demuestran que en la infección por T. cruzi, la IL-10 es indispensable para la mantención en el tiempo, para la correcta activación funcional, migración a órganos blanco de daño y para evitar el agotamiento clonal de la población celular responsable de la erradicación intracelular del parásito, los LT CD8+. Este trabajo aporta nuevos conocimientos acerca de las funciones inmunoestimulatorias de la IL-10 sobre los LT CD8+, aspectos no estudiados en la enfermedad de Chagas hasta el momento. Estos resultados podrían resultar críticos a la hora de diseñar tratamientos con drogas tripanocidas combinadas con inmunomoduladores así como también arrojar luz sobre los factores a tener en cuenta al proponer marcadores inmunológicos de progresión de la enfermedad.
The aim of this work was to study the participation of interleukin 10 (IL-10) on different mechanisms that regulate the homeostasis of CD8+ T cells during infection caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). For this, we have an experimental infection model with T. cruzi in mice from background Balb/c deficient for the IL-10 gene (IL-10 KO). In this model we found that, despite IL-10 the renowed stimulatory functions of this cytokine, in its absence the CD8+ T cell repertoire showed deficiencies in its expansion and functional activation in response to parasite infection. The study of the kinetics of CD8+ T cells in the spleen of infected mice revealed that the defect in the expansion in the IL-10 KO group was seen from acute infection (21 dpi), and correlated with early apoptosis (7 dpi) which was specific for this cell population and not for CD4 + T cells. In turn, we found that the expression of FasL, which increases in activated CD8 + T cells, was decreased in those from the IL-10 KO group at 21 dpi. We evaluated the effector function of CD8+ T cells by simultaneously analyzing the expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IFN-γ) and cytotoxic potential (expression of CD107a in the plasma membrane). Effector function was found to be significantly lower in CD8+ T cells from infected IL-10 KO mice. In turn, the analysis of polyfunctionality did not reveal differences in the profile of this lymphocyte population related to the absence of IL-10 during infection. In agreement with this, the specific in vivo cytotoxic capacity against a T. cruzi transialidase epitope (TSKD14) was significantly lower in the CD8+ T cells of the IL-10 KO group indicating that the impaired induction of effector function of total CD8+T cells was also affecting the T. cruzi- specific fraction. The poorer effector function of CD8+ T cells in absence of IL-10 was associated with a significant increase in the expression of inhibitory markers (PD-1, CTLA-4 and LAG-3) and a significant reduction in the expression of the marker of T-bet activation. Hence, this population exhibits a prematurely exhausted phenotype in response to antigenic stimulation through TCR. By decreasing the parasite load (and consequently the constant stimulation via TCR) in T. cruzi mice infected treated with the parasiticidal drug Benznidazole, the expression of the inhibitory marker PD-1 in the IL-10 KO CD8+ T cells was reduced. In turn, ex vivo treatment of total splenocytes from mice infected with recombinant IL-10 failed to rescue CD8+ T cells from the depleted phenotype but resulted in a reduction of PD-1 expression in KO and WT mice, suggesting that PDL-1 and IL-10R signaling pathways can have compensatory mechanisms. The presence of IL-10 in the microenvironment of lymphoid and peripheral tissues also take part in the events that lead to homing of lymphocytes to target tissues. Absence of IL-10 leads to a greater tissue inflammation, yet we observed fewer total splenocytes arriving to target tissues. In migration assays we observed a differential homing of LT CD8+ according to the organ analyzed. T cells from IL-10 KO mice migrate to the heart to a lesser extent than WTs, and the opposite is observed in the quadriceps. This correlated with less control of the parasite load in the first organ than in the second. When we analyze chemokines produced in the quadriceps and the heart of infected mice, we found that CXCL9 and CXCL10 were overexpressed in both organs in IL-10 KO mice, which is consistent with the greater inflammation of these with respect to WT. But when we analyze CCL5 (whose CCR5 receptor is significantly overexpressed in splenic CD8+ T cells from IL-10 KO mice) we found that absence of IL-10 stimulates its expression in quadriceps, with respect to WT, but not in the heart. This findings correlate with the migration of CD8+ T cells and differential parasitic control in the different organs. From these results, we conclude that splenic CD8+ T cell migration plays an important role in the control of the parasite in infected organs and that there is this differential migration to organs orchestrated by regional differences in CCL5 expression and IL-10 participation. Future experiments will allow us to understand the relationship of CCL5 in the differential migration to organs of this lymphocyte population. Taken together, these results show that during T. cruzi infection, IL-10 is essential for the maintenance, correct functional activation, migration to target tissues and avoidance of exhaustion of the cell population responsible for parasite control within tissues, CD8+ T cells. This work provides novel knowledge about the immunostimulatory functions of IL-10 on CD8+ T cells, an aspect not studied in Chagas disease so far. These results are critical for the design of combined treatments using trypanocidal drugs and immunomodulators, as well as shed light on factors to take into account when proposing immunological markers of disease progression.
Fil: Miranda, Cristian Gabriel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.