Contribución de las proteínas CRISP epididimarias a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano - Sulzyk, Valeria (2025)
Las proteínas de la familia Cysteine-Rich Secretory Proteins (CRISP1-4), con expresión mayoritaria en el tracto reproductor masculino de mamíferos, regulan canales de Ca2+, son claros mediadores del proceso de fertilización y resultan relevantes para la fertilidad de un individuo. En base a ello, en esta Tesis Doctoral nos propusimos explorar el posible empleo de las CRISP para el desarrollo de métodos de regulación de la fertilidad e investigar los mecanismos moleculares por los cuales las CRISP epididimarias son relevantes para la fertilidad a través de su contribución a la fertilización y posterior desarrollo embrionario. Teniendo en cuenta resultados previos de nuestro laboratorio en roedores y primates mostrando que la inmunización con la proteína CRISP1 induce la producción de anticuerpos específicos capaces de unirse a los espermatozoides, así como de inhibir la fertilidad sin producir efectos deletéreos, como primer objetivo nos propusimos identificar proteínas epididimarias CRISP en perros como posibles blancos anticonceptivos para el control de la creciente población canina callejera. Los resultados obtenidos revelaron la existencia de una proteína CRISP canina de expresión exclusivamente epididimaria, presente en los espermatozoides tanto epididimarios como eyaculados la cual no sólo permanece en los mismos luego de la capacitación, sino que se relocaliza al segmento ecuatorial, región involucrada en la fusión de gametas en todas especies estudiadas. Estas observaciones, junto al hecho de que la exposición de espermatozoides caninos a un anticuerpo capaz de reconocer a la proteína canina inhibiera significativamente la capacidad de los espermatozoides de penetrar el cúmulus de células que rodea al ovocito, apoya la participación de la proteína CRISP canina identificada en el proceso de fertilización y su futuro empleo como blanco para el desarrollo de un método anticonceptivo canino no hormonal. Dada la subfertilidad observada en las colonias de ratones doble KO para CRISP1 y CRISP4 (DKO 1/4) y para CRISP1 y CRISP3 (DKO 1/3) debidas a defectos exclusivos de fertilización y desarrollo embrionario, respectivamente, así como la infertilidad de las colonias carentes de más de dos proteínas simultáneamente, como segundo objetivo de esta Tesis nos propusimos generar y caracterizar una nueva colonia triple KO carente de CRISP1, CRISP3 y CRISP4 con el fin de analizar la relevancia de los diferentes miembros de la familia CRISP para la fertilidad. Los resultados indicaron que mientras la nueva colonia TKO mostró una mayor bajada en la fertilidad respecto a las colonias DKO 1/4 y 1/3, no alcanzó la infertilidad observada en la colonia TKO 1/2/3 previamente estudiada. El análisis del fenotipo reproductivo reveló la ausencia de defectos en la fertilización in vivo, a diferencia de lo observado en el modelo DKO 1/4, detectándose, en cambio, una bajada significativa en el desarrollo embrionario, tal como la observada para los animales DKO 1/3. A pesar de que todos los parámetros espermáticos estudiados resultaron normales, los espermatozoides TKO fueron prácticamente incapaces de fertilizar ovocitos in vitro, en concordancia con lo observado en todos los modelos carentes de CRISP4. En conjunto, esta caracterización permitió confirmar que la infertilidad no dependería exclusivamente de la cantidad sino de la combinación de proteínas delecionadas, contribuyendo a una mayor comprensión de los mecanismos de redundancia y compensación funcional entre los miembros de la familia CRISP. Como último objetivo de esta Tesis, nos propusimos investigar los mecanismos moleculares por los cuales las proteínas epididimarias CRISP1 y CRISP3 contribuyen al desarrollo embrionario temprano que afecta la fertilidad de todas las colonias carentes de estas proteínas. Los resultados obtenidos utilizando la colonia DKO 1/3, que solo exhibe defectos de desarrollo embrionario, indicaron que dichos defectos ya son acarreados por los espermatozoides epididimarios y no son debido a un retraso en la fertilización. Un hallazgo interesante fue que los ovocitos fertilizados in vitro por los espermatozoides mutantes mostraron un arresto en el reinicio de la meiosis no causado por alteración en las oscilaciones de Ca2+ durante la activación ovocitaria sino por niveles elevados de fragmentación del ADN espermático adquiridos durante el tránsito por el epidídimo. Nuestras observaciones también mostraron que la exposición de espermatozoides control a fluido epididimario de animales mutantes o a fluido control suplementado con Ca2+ incrementó significativamente la fragmentación del ADN y que los espermatozoides mutantes tanto frescos como capacitados exhibían niveles significativamente mayores de Ca2+ intracelular. En conjunto, estas observaciones nos permiten concluir que una desregulación en la homeostasis del Ca2+ durante la maduración epididimaria sería la responsable del daño en la integridad del ADN espermático que conduce al retraso en el reinicio de la meiosis y los consecuentes defectos en el desarrollo embrionario temprano, apoyando la relevancia de la maduración epididimaria más allá de la conocida adquisición de capacidad fertilizante. Consideramos que los resultados obtenidos en esta tesis utilizando como modelo a la familia de proteínas CRISP contribuirán a una mayor comprensión de la mecanismos moleculares involucrados en los procesos de fertilización y embriogénesis como así también al desarrollo de nuevos y mejores métodos tanto de regulación de la fertilidad como de diagnóstico y tratamiento de la fertilidad.