Regulación transcripcional y post-transcripcional de la subunidad Tpk1 de PKA de Saccharomyces cerevisiae por estrés térmico - Cañonero, Luciana (2022)
Existen varios niveles de control que interactúan en forma dinámica y coordinada para mantener la especificidad de la señalización: la secuencia blanco alrededor del sitio de fosforilación, la presencia o ausencia de proteínas que permiten el anclaje de la quinasa a través de la subunidad regulatoria y que regulan de esta manera la interacción quinasa–sustrato, la localización subcelular diferencial de las subunidades catalíticas frente a distintos estímulos y los niveles de expresión del sustrato y la quinasa. La PKA de S.cerevisiae es una holoenzima compuesta por un dímero de subunidad regulatoria, Bcy1, y dos subunidades catalíticas, Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Las distintas subunidades se expresan diferencialmente en condiciones como el estrés térmico y salino o disponibilidad y tipo de fuente de carbono. La regulación de la expresión de cada subunidad de la holoenzima es uno de los niveles de control que determinan la especificidad de la respuesta cAMP-PKA. El objetivo general de este trabajo fue contribuir a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la especificidad en la vía de señalización de cAMP-PKA en S.cerevisiae. En esta tesis estudiamos el mecanismo a través del cual la vía cAMP-PKA media su respuesta especifica al estrés térmico y a la adaptación térmica en la levadura. Demostramos que frente al estrés térmico a 37°C se inducen los niveles del mRNA de TPK1. Este incremento resulta de un aumento tanto en la actividad del promotor de TPK1 como de la vida media del transcripto. Sin embargo, no se detecta ningún cambio en los niveles de proteína Tpk1. Durante el estrés térmico el mRNA de TPK1 se ensambla en gránulos citoplasmáticos. Los gránulos resultan resistentes al tratamiento con cicloheximida y en un perfil de polisomas el transcripto de TPK1 se encuentra en mayor proporción en las fracciones que contienen monosomas o RNA libre, indicando que su traducción se encuentra inhibida. La regulación de la expresión de TPK1 se evaluó también durante condiciones de estrés térmico que promueven la termotolerancia. Una levadura que se expone de manera abrupta a un estrés térmico responderá de una forma menos eficiente que si, antes de exponerla a la temperatura elevada, se la somete por un período corto de tiempo a una temperatura no letal por encima de la óptima. En este caso la levadura adquiere una mayor capacidad de sobrevivir al estrés térmico. Este fenómeno se conoce como inducción de termotolerancia. En estas condiciones, realizando dos incubaciones a 37°C separadas por períodos de recuperación a 25°C, se observó que los gránulos que contienen mRNA de TPK1 son dinámicos, ensamblándose y desarmándose durante los cambios de temperatura. Mientras los niveles de mRNA aumentan en los períodos de incubación a 37°C, los niveles de proteína Tpk1 están significativamente aumentados en el periodo final de recuperación a 25°C. Entre los caminos que se activan en respuesta al estrés térmico en S. cerevisiae, se encuentra la vía CWI (Integridad de la pared celular). Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la expresión de TPK1, se analizó el entrecruzamiento entre las vías CWI y cAMP-PKA. Demostramos que el sensor Wsc3 es necesario para la regulación de la expresión de TPK1 durante el estrés térmico. De la cascada MAPK, que forma parte de la vía CWI y rio abajo del sensor, sólo la quinasa Mkk1 y el factor de transcripción Swi4 poseen un rol en la expresión de TPK1, en respuesta a este tipo de estrés. El ensamblado de los focos en el estrés térmico depende del sensor Wsc3. La expresión de proteína Tpk1 durante la termotolerancia es menor en una cepa mutante wsc3Δ que en la cepa WT. Se correlacionaron los cambios de expresión con la actividad PKA in vivo y consecuentemente al aumento de Tpk1 en la termotolerancia, se determinó que la actividad PKA en las células mutantes wsc3Δ resulta más baja. Todos estos resultados evidencian la participación de la vía CWI en la expresión de TPK1 durante el estrés térmico y aportan un antecedente más al entrecruzamiento de la vía CWI y PKA. Finalmente, realizamos experimentos para demostrar que la regulación de la expresión de la subunidad TPK1 en respuesta al estrés térmico, redunda en un cambio en la proporción de las isoformas que conforman la holoenzima. Demostramos que la cantidad de la isoforma Tpk1 en la holoenzima es significantemente mayor durante el segundo período de recuperación a 25°C, comparando con cualquiera de las otras condiciones testeadas. Los resultados en su conjunto indican la existencia de un mecanismo que regula la expresión de la subunidad Tpk1 frente a un determinado estímulo como es el estrés térmico. El incremento en la actividad de PKA dependiente de Tpk1 durante la adaptación celular al estrés por calor podría contribuir a la aptitud celular general cuando se restablecen condiciones ambientales más favorables. Los resultados indican la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de TPK1 que permite ajustar la especificidad de cAMP-PKA para que la célula logre la mejor respuesta a un determinado estímulo.