Efectos de AKT1 y dependencia de su SUMOilación en procesos relevantes para el mantenimiento de la pluripotencia en células madre embrionarias

• Autores: Francia, Marcos Gabriel
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: AKT1; AKT1 E17K; CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; DINAMICA DE INTERACCION; ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA; FACTORES DE TRANSCRIPCION DE PLURIPOTENCIA; HP1α; MICROSCOPIA CONFOCAL DE CELULAS VIVAS; NANOG; SUMOilacion; UBC9 (C93S); AKT1; AKT1 E17K; EMBRYONIC STEM CELLS; FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY; HP1α; LIVE CELL CONFOCAL MICROSCOPY; NANOG; PLURIPOTENCY TRANSCRIPTION FACTORS; SUBCELLULAR DISTRIBUTION; SUMOylation; UBC9 (C93S)
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre embrionarias (CME) se obtienen del macizo celular interno de blastocistos de mamíferos, y en condiciones adecuadas de cultivo tienen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente y de diferenciarse a todos los tipos celulares de un organismo adulto. Estas características las posicionan no sólo como un excelente sistema experimental para la investigación en biología del desarrollo, sino también en el modelado de enfermedades, evaluación de fármacos y como una gran promesa en el área de la medicina regenerativa. Las propiedades fundamentales de las CME son mantenidas principalmente por los factores de transcripción (FTs) NANOG, OCT4 y SOX2, que juntos constituyen el core de pluripotencia que induce la expresión de genes cruciales del estado pluripotente e inhibe aquellos que promueven la diferenciación celular. Si bien hoy en día se conoce un gran número de factores y vías involucradas, dada la complejidad de esta red regulatoria, aún siguen en estudio los mecanismos moleculares que regulan el estado pluripotente en CME. Entender en profundidad estos procesos es fundamental para la futura aplicación segura de estas células en pacientes. La quinasa de serina y treonina AKT, también conocida como PKB, media la acción de una gran variedad de estímulos, regulando así diversos procesos celulares. En particular en CME, AKT juega un papel fundamental en el mantenimiento de las propiedades fundamentales de estas células, promoviendo su supervivencia e induciendo la expresión de Nanog. La activación de AKT se produce como consecuencia de su fosforilación en sitios específicos; sin embargo, tanto su actividad quinasa como su especificidad de sustratos son regulados finamente por otras múltiples modificaciones posttraduccionales (MPTs), incluyendo la SUMOilación. Esta MPT juega un papel importante en la regulación de la función, localización, estabilidad e interacciones de un gran número de proteínas. Los primeros reportes sobre la SUMOilación de AKT cumplen su primera década, y desde entonces solo un puñado de trabajos profundizaron sobre los efectos de esta MPT en la función de esta quinasa. En particular, se ha encontrado que la SUMOilación de AKT tiene efectos sobre diversos procesos celulares como la supervivencia, la proliferación, el splicing, e incluso el potencial oncogénico de ciertas líneas celulares, pero su efecto en CME no había sido estudiado. Por lo tanto, dada la importancia de AKT en el contexto pluripotente y la relevancia de la SUMOilación en su función, postulamos que la SUMOilación de AKT podría tener un papel relevante en el mantenimiento del estado pluripotente en CME. Para poner a prueba esta hipótesis, estudiamos en primer lugar los efectos de la SUMOilación de AKT1 sobre la expresión del FT de pluripotencia Nanog. Para esto estudiamos el efecto de mutantes de AKT1 con diferente capacidad de ser SUMOiladas, incluyendo la mutante AKT1 E17K encontrada en varios tipos de cáncer, e interferimos con el proceso de SUMOilación mediante transfección de una mutante dominante negativa de la enzima UBC9, conjugadora del grupo SUMO y clave para el proceso de SUMOilación. Encontramos que AKT induce la expresión de Nanog de manera dependiente de su SUMOilación. Para estudiar el mecanismo molecular subyacente utilizamos diferentes abordajes para explorar la participación de diversos blancos de AKT, FTs y vías triviales que vinculan a AKT con la expresión de Nanog en CME. Nuestro análisis sugirió que ninguno de los factores estudiados es un mediador exclusivo o indispensable en la inducción de Nanog por AKT. Sin embargo, la exploración del efecto de AKT1 en diferentes contextos celulares, en conjunto con un análisis bioinformático, nos condujeron a nuevos candidatos. Por otro lado, dado que la SUMOilación afecta la compartimentalización de diversas proteínas, hipotetizamos que esta MPT podría también impactar en la distribución subcelular de AKT1, modulando por este mecanismo su función y especificidad. Para estudiar esta hipótesis, generamos proteínas de fusión a la proteína fluorescente mCherry de las variantes de AKT1 con diferente capacidad de ser SUMOiladas, lo que nos permitió llevar a cabo distintos estudios utilizando microscopía confocal de células vivas. Encontramos que la SUMOilación modula la compartimentalización y distribución subcelular de AKT1, especialmente promoviendo su traslocación al núcleo. Este hallazgo nos llevó a estudiar el efecto sobre diferentes parámetros nucleares relacionados con la regulación de la expresión génica. Encontramos que las diferentes variantes de AKT1 afectan de manera diferente la distribución de la proteína asociada a heterocromatina 1α, indicando que esta MPT sobre AKT puede impactar en el estado de compactación de la cromatina. Dado que los cambios en el estado de la cromatina pueden afectar la interacción de los FTs con sus sitios blanco dentro del genoma, nos propusimos estudiar la organización subnuclear y la dinámica de interacción con la cromatina de los principales FTs de pluripotencia y su relación con la SUMOilación de AKT1. Para esto utilizamos además la técnica de espectroscopía de correlación de fluorescencia en CME vivas. Nuevamente encontramos que las diferentes variantes afectan tanto la distribución de OCT4 y SOX2, como la interacción con la cromatina de OCT4, SOX2 y NANOG, posiblemente impactando en su función. En conclusión, en este trabajo demostramos que la SUMOilación de AKT1 impacta en procesos relevantes para el mantenimiento de la pluripotencia en CME de ratón.
Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the inner cell mass of mammalian blastocysts, and, under appropriate culture conditions, they can self-renew indefinitely and differentiate into all cell types of an adult organism. These characteristics position them not only as an excellent system for research in developmental biology, but also in disease modeling, drug testing, and as a great promise in the field of regenerative medicine. The fundamental properties of ESCs are primarily maintained by the transcription factors (TFs) NANOG, OCT4, and SOX2, which together constitute the core of pluripotency that induces the expression of key genes for the pluripotent state and repress those that promote cell differentiation. Given the enormous complexity of this regulatory network, although many factors and pathways are known, the molecular mechanisms that regulate the pluripotent state in ESCs are still under study. A deep understanding of these processes is essential for the future safe application of these cells in patients. The serine/threonine kinase AKT/PKB, mediates the action of a wide variety of stimuli, thereby regulating a great number of cellular processes. AKT plays a key role in the maintenance of the fundamental properties of ESCs, promoting their survival and inducing the expression of Nanog. The activation of AKT occurs as a result of its phosphorylation in specific sites; however, both its kinase activity and its substrate specificity are finely regulated by other multiple post-translational modifications (PTMs), including SUMOylation. This PTM plays an important role in the regulation of the function, localization, stability, and interactions of many proteins. Since the first reports on AKT SUMOylation a decade ago, only a few studies have explored the effects of this PTM on the function of this kinase. It has been found that it has effects on various cellular processes such as survival, proliferation, splicing, and even on the oncogenic potential of certain cell lines, but the effect of AKT SUMOylation in ESCs has not been studied yet. Therefore, given the importance of AKT in the pluripotent context and the relevance of the SUMOylation in its function, we postulate that SUMOylation of AKT could have a relevant role in the maintenance of the pluripotent state in ESCs. To test this hypothesis, we first studied the effects of AKT1 SUMOylation on the expression of the pluripotency TF Nanog. To do this, we studied the effect of AKT1 mutants with different SUMOylatability, including the AKT1 E17K mutant found in several types of cancer, and also interfered with the SUMOylation process by transfecting a dominant-negative mutant of the UBC9 enzyme. This enzyme normally conjugates the SUMO group to its targets and is key for the SUMOylation process. We found that AKT induces Nanog expression in a SUMOylation-dependent manner. To study the underlying molecular mechanism, we used different approaches to explore the involvement of several AKT targets, TFs, and trivial pathways that link AKT to Nanog expression in ESCs. Our analysis suggested that none of the factors studied is an exclusive or indispensable mediator in the induction of Nanog by AKT. However, the exploration of the effect of AKT1 in different cellular contexts, together with a bioinformatics analysis, led us to new candidates. On the other hand, since SUMOylation affects the compartmentalization of various proteins, we hypothesized that this PTM could also impact on the subcellular distribution of AKT1, modulating its function and specificity also through this mechanism. To study this hypothesis, we generated fusion proteins to the fluorescent protein mCherry, of the AKT1 variants with different SUMOylatability. This approach allowed us to carry out different studies using confocal microscopy of living cells. We found that SUMOylation modulates the compartmentalization and subcellular distribution of AKT1, especially promoting its translocation to the nucleus. This finding led us to study the effect on different nuclear parameters related to gene expression regulation. We found that the different AKT1 variants affect the distribution of the heterochromatin protein 1α in a different way, indicating that this PTM on AKT can impact on chromatin compaction. Since changes in the chromatin landscape affects the interaction of TFs with their target sites within the genome, we decided to study the subnuclear organization and the dynamical interaction to the chromatin of the main pluripotency TFs and their relationship with AKT1 SUMOylation. For this purpose, we also used fluorescence correlation spectroscopy in living ESCs and found that the different AKT1 variants affect both the distribution of OCT4 and SOX2, as well as the interaction to the chromatin of OCT4, SOX2, and NANOG, possibly having an impact on their function. In conclusion, in this work we demonstrate that AKT1 SUMOylation impacts on different processes relevant for the pluripotency maintenance in mouse ESCs.
Fil: Francia, Marcos Gabriel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.