Rol de la vía FGF2/FGFR en la resistencia a la terapia hormonal en cáncer de mama - Sahores, Ana (2016)
El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) yprogesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no respondenal tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresiónde la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a laresistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4)y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 ylas de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que,en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre laexpresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapiaendocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada ennumerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer demama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de laenfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante laadquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluarel rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados ennuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que lasvariantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayoresniveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos queel FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresiónde las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayoresniveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayosde ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localizaciónes mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios decélulas epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta laproliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, eltratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibesignificativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familiastumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivocon el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobreel crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos deregresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e invivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlaciónpositiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que,en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en elepitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en lasvariantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos oadquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano,para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con altaexpresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistentea MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistentepresenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las treslíneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformasde 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. Enensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamientoendocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaronsignos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Estose evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo ytejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e-YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e-YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de susreceptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales deproliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en laprogresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonalvinculada a HMW-FGF2.