Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica - Fauerbach, Jonathan Arturo (2013)
La Enfermedad de Parkinson (EP) es el desorden neurodegenerativo motor más frecuente,caracterizado por la presencia de agregados proteicos amiloideos intra y extraneuronalesconocidos como Cuerpos de Lewy (CL). El principal componente de estas estructuras esalfa-sinucleína (AS), una proteína presináptica de 140 aminoácidos abundante en célulasdopaminérgicas del cerebro aunque su función fisiológica permanece aún desconocida. Ensu forma libre nativa AS carece de una estructura secundaria definida pudiendo adoptarmúltiples conformaciones en solución y en asociación con otras proteínas y membranas. Secree que los CL y las fibras amiloides maduras (mafs) son el resultado de un proceso demal plegamiento, auto-ensamblado y asociación de AS y que posiblemente sirven comomecanismos de protección para la célula, a través de la redistribución en la población de lasespecies tóxicas intermediarias solubles asociadas a etapas tempranas. Estudio in vitro delas especies y procesos involucrados en la agregación de AS brindan la posibilidad deentender los mecanismos subyacentes en EP. El diseño de nuevas formas de detección delas especies intervinientes en el proceso de agregación y el estudio de los mecanismos deformación de dichos intermediarios tempranos poseen una alta importancia. En esta tesis, se sintetizaron sondas fluorescentes sensibles a cambios en la polaridad desu microentorno que permiten monitorear el proceso de auto-ensamblado y asociación de AS marcada covalentemente con estos compuestos. Dichas sondas demuestran una muyalta sensibilidad al proceso en estudio, proveyendo una novedosa metodología demonitoreo en continuo con la mínima perturbación del sistema. Diversas sondas fueronsintetizadas basándose en la familia de las 3-hidroxicromonas (3HC), compuestosaltamente sensibles a los cambios de polaridad de su entorno. Su particular estructuraquímica posibilita el fenómeno conocido como ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer o Transferencia Protónica Intramolecular en el Estado Excitado’). En ESIPT seproduce una transferencia protónica intramolecular en el estado excitado obteniendo dosformas excitadas cada una con un nivel de energía distinto. Con lo cual estos compuestosfluorescentes ESIPT presentan dos bandas de emisión en lugar de una sola. La posición,intensidad y relación entre las bandas de emisión se modifican de acuerdo a los cambios enla polaridad, formación de enlaces por puentes de hidrógeno, y acidez/basicidad delmicroentorno de la sonda. Las nuevas sondas 3HC sintetizadas resultaron reporteros muyversátiles para el proceso de agregación de AS, particularmente sensibles a las etapastempranas a cuyos agregados de AS se les adjudica la mayor citotoxicidad. La combinaciónde distintas sondas de polaridad han permitido obtener datos experimentales acerca de laformación y desaparición de intermediarios pre-amiloideos transientes. Las curvas de agregación obtenidas y sus cambios espectroscópicos fueroncomplementadas con un análisis por Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Mediante unestudio sistemático por AFM se lograron identificar las diferentes especies provenientes delproceso de autoensamblado de AS, donde cada una de las especies fue caracterizada ycatalogada. Estudios a diferentes temperaturas permitieron evaluar su influencia en lacinética y termodinámica del proceso de agregación. Incubaciones a baja temperatura (4°C) permitieron definir un mínimo local de energía en la coordenada de la agregación,revelando una novedosa especie supramolecular (la "acuna") que muestra indicios de estardirectamente involucrada en el paso clave de la formación de estructuras fibrilares. Estudios preliminares sobre células SH-SY5Y en cultivo dan indicios de que las acunas soncitotóxicas. A través de la Crio-Microscopía de Transmisión Electrónica (Cryo-ET) se obtuvoinformación estructural con resolución sub-nm de esta novedosa especie supramolecular. Los estudios dieron lugar a la formulación de un nuevo esquema secuencial de agregación (SAS) para AS, basándose en conceptos de química coloidal, de polímeros ysupramolecular. SAS distingue 3 etapas de la agregación: molecular, coloidal y fibrilar, enfunción de las estructuras halladas, su orden secuencial lineal y orquestado deinterconversión, su presencia transiente (aparición y desaparición) y morfologíacaracterística. Además, SAS distingue etapas exergónicas y endotérmicas del procesoglobal, señalando un mínimo local de energía correspondiente con la formación de la acuna. Se prevé que este modelo pudiera ser útil no sólo para AS sino para otras proteínasamiloideas “intrínsicamente desordenadas” asociadas a enfermedades neurodegenerativassimilares, abriendo la posibilidad de la existencia de un mecanismo común y unificado. Esta tesis doctoral involucra un estudio desde lo sintético orgánico y la biofísica estructural,utilizando microscopias de alta resolución y herramientas fluorescentes avocadas al estudioy la descripción del proceso integro de agregación de AS, obteniendo nuevos datosrelevantes al área que son interesantes de continuar y ser explorados por el aporte quepuedan rendir en el contexto biomédico.