Interacciones del radical libre triclorometilo con componentes celulares y su participación en los efectos tóxicos y potencialmente carcinogénicos del tetracloruro de carbono - Castro, Gerardo Daniel (1990)
El estudio de los mecanismos por los cuales lassustancias químicas producen daños en un ser viviente sepuede realizar de modo más simple y racional con el empleo desistemas modelo de experimentación. El tetracloruro decarbono actuando sobre el hepatocito es un clásico en lainvestigación toxicológica y en patología. Todavia quedamucho por entender acerca de las reacciones químicas queocurren entre este tóxico y los distintos componentescelulares y que son la causa primaria de todos los procesosque conducen a los varios tipos de daños observados. En el campo de la carcinogénesis química, dos razonesapoyan el empleo de este modelo experimental: el tetraclorurode carbono es un representante de una extensa familia desustancias químicas carcinogénicas con mecanismo de accióndesconocido. Por otra parte, desde el punto de vistaambiental, la carcinogénesis hepática por CCl4 es un problemarelevante por él mismo y por otros solventes clorados deamplio uso industrilal. En el presente trabajo de pretendió aportar alconocimiento de la química de las interacciones de CCl4 concomponentes celulares, actuando éste sobre el hepatocito. Además se propone una nueva hipótesis para entender elmecanismo de acción iniciadora de la carcinogénesis de estecompuesto, que por su naturaleza general sería extrapolable aotros carcinógenos. Se estudió la capacidad de interacción de metabolitosreactivos del tetracloruro de carbono (principalmenteradicales libres triclorometilo) con el ADN y con proteínasnucleares, la peroxidación de lípidos hepática (total ynuclear) estimulada por CCl4 y la biotransformación de CCl4a CHCl3 en hígado (total y en núcleos); en tres especiesanimales con diferente respuesta a la carcinogénesis hepáticainducida por CCl4. Ellas fueron el hamster sirio dorado, elratón C3H y la rata Sprague Dawley. La susceptibilidad hacia este carcinógeno sigue el orden:hamster ≥ ratón C3H >> rata Sprague Dawley = O. No se observó correlación entre el grado desusceptibilidad de esas especies y la intensidad de lasinteracciones (expresadas como unión covalente de 14C) demetabolitos reactivos de CCl4 con el ADN. Se observó correlación, en cambio, entre la intensidadde las interacciones con proteínas nucleares totales y larespuesta carcinogénica a CCl4 en esas especies. Cuando se efectuaron estudios sobre distintas fraccionesde las proteinas nucleares (solubles I y II, histonas,desoxirribonucleoproteinas I y II, ribonucleoproteínasacídicas y proteínas residuales) se verificó la existencia deuna correlación entre intensidad de las interacciones demetabolitos reactivos de CCl4 (unión covalente de 14C) conlas fracciones acídica y residual, y la respuestacarcinogénica de las tres especies al CCl4. Se verificó que preparados nucleares de hígado dehamster, de ratón C3H y de rata Sprague Dawley son capaces debiotransformar CCl4 a CHCl3 y de estimular (en atmosferaaerobia) la peroxidación de sus lípidos en presencia de CCl4y en presencia o ausencia de NADPH. No hubo correlación entreperoxidación nuclear (o en tejido entero) y la conocidarespuesta carcinogénica de las tres especies. Habría sinembargo alguna correlación entre la capacidadbiotransformadora de CCl4 a CHCl3 en preparados nucleares yla susceptibilidad a la carcinogénesis por CCl4. No seobservó lo equivalente en tejido hepático entero. Se observaron interacciones entre radicales libres *CCl3 (generados por acción iniciadora de peróxido de benzoilosobre CCl4) y las cuatro bases del ADN: guanina, adenina,citosina y timina (detección por FID, CE y EM). En los cuatrocasos se intentó realizar la identificación estructural delos productos formados por espectrometia de masas. No se hanobtenido aún resultados positivos. Las fragmentacionesgeneradas por los derivados trimetilsililados son escasas yello dificulta la interpretación de los espectros (ver Resultados). Es nuestra intención proseguir en el futuro conla identificación estructural, intentando modos alternativosde derivatización u otras técnicas espectroscópicas. Se evidenciaron interacciónes entre radicales libres *CCl3 (generados por acción iniciadora de peróxido debenzoilo sobre CCl4) y varios aminoácidos (fue estudiada lareacción con 18 aminoácidos). Los aminoácidos arginina,aspártico, glutámico, glicina, leucina, lisina, norleucina yvalina no mostraron reaccionar de modo apeciable. Losrestantes (cisteina, cistina, metionina, fenilalanina,histidina, prolina, serina, treonina, triptofano y tirosina)reaccionaron con distinto grado de intensidad. Para algunos (metionina, fenilalanina y tirosina) fue posible identificarproductos de interacción, ya fuera aductos clorados,productos de fragmentación, etc. En los casos de metionina y de fenilalanina observamosla ocurrencia de interacciones que no pueden ser consideradascomo unión covalente de metabolitos reactivos o peroxidaciónde lípidos inducida por CCl4. Se trata de alteracionesinducidas sobre los aminoácidos que implican la fragmentaciónde la molécula. Para metionina pudimos observar la formaciónde dimetildisulfuro y de metanotiol, en un sistema deincubación microsomal "in vitro". Ambos productos derivariande la fragmentación de la cadena lateral del aminoácido paradar radicales libres *SCH3. Fenilalanina mostró también ser capaz de generarproductos de degradación como el benceno, que fue observadoen incubaciones de microsomas hepáticos. Hemos visto que el tetracloruro de carbono, que produceuna variedad de alteraciones y daños en el higado, semetaboliza a especies muy reactivas que interaccionan conproteinas, lípidos y ácidos nucleicos, y que esasinteracciones son la causa original de las alteraciones quemás o menos directamente conducirán a los efectos tóxicosvisibles. Se desprende de esto la importancia que tieneconocer en lo posible la química de esas interacciones puesello nos permitirá a su vez entender mejor cada efectoobservado en los parámetros que midamos, nos permitirápredecir tipos y localizaciones de otras alteracionesprobables y por último dará las pautas para diseñartratamientos que neutralicen o eviten algunas de esasinteracciones y/o sus consecuencias. Si tenemos en cuenta además la relevancia del sistema CCl4-hepatocito como modelo experimental de daño celular,extrapolable a situaciones de otros tóxicos-hepatocito, CCl4-otros órganos, otros tóxicos-otros órganos o aún otrostóxicos-otros seres vivos, resulta obvio el interés que paranosotros y otros laboratorios tiene investigar en este campo,por la generalidad que puede asignarse a los resultados quese obtengan (15, 158). En este trabajo se ha pretendido aportar al conocimientode las interacciones de metabolitos reactivos de CCl4 conaminoácidos y bases de ácidos nucleicos, pues es muy poco lorealizado hasta ahora en el tema. Somos conscientes de lacantidad de trabajo experimental que implican estos objetivospero justamente nuestra intención es continuar con esta lineaen el futuro. Un hallazgo a nuestro juicio novedoso, comprende a losresultados obtenidos con metionina y en parte confenilalanina. Encontramos mecanismos de alteración de loscomponentes celulares que no corresponden a los tradicionalesen la toxicología del CCl4 y de otros tantos compuestos (unión covalente de metabolitos y peroxidación de lípidos)pero que son completamente justificados por la naturalezaquimíca de los productos de biotransformación de CCl4, estoes fundamentalmente el radical libre triclorometilo. Desdeque se postula la formación ya sea "in vivo" o "in vitro" deun radical libre, deben esperarse en principio todas lasinteracciones que normalmente realiza tal especie (abstracciones, adiciones, dimerizaciones, etc.). Lo queencontremos en la situación real dependerá del medio en quese haya formado, qué otras moléculas se hallen presentes, laestabilidad de los productos formados, etc., eso es lo queaporta el medio biológico. Este razonamiento, que puedeparecer trivial, ha sido sin embargoresistido en el medio deinvestigación toxicológico o en patología, limitándoseexclusivamente a considerar las interacciones tóxico-medio entérminos de uniones covalentes y/o peroxidación de lípidos. En determinados casos incluso, la sola existencia deradicales libres suponía peroxidación de lípidos como causaexcluyente de las patologías observadas. Es en este sentidodonde creemos haber hecho un aporte relevante, al señalarmecanismos de interacción posibles simplemente reconociendoal tóxico como una sustancia química que reaccionará como taly que debe estarse atento a considerar todos los tipos deinteracción posibles, de acuerdo a su naturaleza. En lo que se refiere a carcinogénesis química,consideramos que el tetracloruro de carbono puede servir comoun buen modelo para estudiar el modo de acción de nmchoscarcinógenos no genotóxicos. La buena correlación obtenidaentre unión covalente a proteínas nucleares (y entre éstas alas acídicas) y susceptibilidad a la inducción de tumores endistintas especies, nos hace pensar en que la hipótesispropuesta puede ser válida. En efecto, las alteraciones quepueda producir un metabolito reactivo como un radical libreinteraccionando con los distintos aminoácidos muyprobablemente alteren o anulen las funciones de las proteínasreguladoras de la expresión genética. Esto permitiría laexpresión de zonas del genoma que usualmente no se expresan yasi comenzaría la transformación de la célula. Por otra parte, creemos que esta hipótesis esextrapolable a muchos otros carcinógenos epigenéticos, ya quela ide Consulte el resumen completo en el documento.