Rol del eje Galectina-1/glicanos durante los procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama - Perrotta, Ramiro Martín (2021)
Las galectinas son una familia de proteínas capaces de decodificar la información contenida en glicanos presentes tanto en la superficie celular como en la matriz extracelular, modulando así distintos procesos fisiopatológicos. En particular, galectina-1 (Gal1) se une a los residuos terminales de N-acetilactosamina en N- y en O-glicanos, sólo si estos carecen de terminales de ácido siálico (AS) en posición α2-6 (glicofenotipo permisivo para la unión de Gal1). El objetivo principal de mi proyecto de tesis doctoral es explorar el rol del eje Gal1/glicanos tanto en la mama normal como neoplásica, haciendo foco en cómo esta interacción modula los procesos de invasión y diseminación metastásica. En primer lugar, nos propusimos identificar cuáles son las células productoras de Gal1 en la mama normal murina y humana utilizando datos públicos de estudios de single cell RNA sequencing (scRNAseq) que abarcan las distintas fases del desarrollo mamario. Observamos que en la mama normal Gal1 (codificada por el gen Lgals1) se expresa principalmente en las células del linaje basal/mioepitelial y en células madre multipotenciales (MaSC). Utilizando la técnica de RNA velocity, comprobamos la dinámica de expresión de Gal1 en dichos linajes celulares. Para analizar más en profundidad la relevancia de Gal1 en el epitelio mamario, se analizaron las mamas normales de ratones C57BL/6 WT y Lgals1-/- (Gal1KO) luego de promover la ramificación de los ductos y las terminales con el análogo sintético de la progesterona MPA. Sorpresivamente observamos que los ratones Gal1KO tenían severamente afectada la capacidad de desarrollar las ramificaciones terminales, antes y después de ser estimulados con MPA, sugiriendo que Gal1 cumple un rol relevante en la fisiología de la glándula mamaria. Debido a que las células neoplásicas son capaces de cooptar los mecanismos fisiológicos de diseminación e invasión para generar metástasis, nos propusimos investigar el rol de Gal1 en el modelo murino transgénico para el oncogén HER2 FVB/N-Tg (MMTV/NeuT), capaz de desarrollar lesiones preneoplásicas y metástasis entre las 14 y 18 semanas de vida. Datos provenientes del análisis de RNAseq revelaron que Gal1 se regula positivamente en lesiones tempranas tumorales (LT: 14 semanas) con respecto a los tumores primarios (TP: 18 semanas) sugiriendo que la expresión de esta lectina constituye un evento temprano en fenómenos de tumorigénesis. Estos resultados sugieren que la expresión de Gal1 y su unión a las células tumorales podrían estar asociadas a la diseminación tumoral. En efecto, observamos que el tratamiento de cultivos 3D de LT con Gal1 promovió un fenotipo invasivo caracterizado por el aumento de marcadores de células madre tumorales (CSC) y transición epitelio mesenquimal (TEM) tales como TWIST, SNAIL y SLUG y la disminución de E-caderina. Posteriormente, nos propusimos analizar la relevancia de Gal1 en procesos de diseminación y metástasis en cáncer de mama humano HER2+. Para ellos, seleccionamos líneas tumorales de mama humanas con distinto potencial metastásico (JIMT-1 y BT- 474). La línea JIMT-1 (más agresiva) presentó mayor expresión de Gal1 y menor expresión de la sialiltransferasa ST6Gal1 que cataliza la adición de AS en posición α2-6. A partir de estos hallazgos hipotetizamos que la unión de Gal1 a la célula tumoral podría promover un fenotipo maligno. En este contexto observamos que el tratamiento con Gal1 de la línea JIMT-1, incrementó la frecuencia de CSC (CD44high/CD24low). A su vez, promovió la migración celular, un aumento de marcadores de TEM y fomentó la formación de mamosferas en cultivo. Para evaluar el efecto in vivo de la administración de Gal1 utilizamos un PDX (patient derived xenograft) derivado de una paciente con cáncer de mama HER2+; donde el tratamiento con Gal1 recombinante (intratumoral) promovió un aumento en la diseminación metastásica en el pulmón del huésped. Para determinar la relevancia clínica de nuestros hallazgos analizamos bases de datos públicas con información transcriptómica de pacientes con cáncer de mama (TCGA-BRCA). Encontramos que aquellos pacientes con tumores de mama de todos los subtipos que presentaban simultáneamente alta expresión de mensajero de Gal1 (LGALS1) y bajos niveles de ST6GAL1 (LGALS1high/ST6GAL1low), evolucionaron con un peor pronóstico y una menor sobrevida libre de enfermedad. Mas aún, el análisis de enriquecimiento (GSEA) reveló que dichos pacientes tienen regulada positivamente la vía de TEM, e inhibidas las vías asociadas a la respuesta inmune antitumoral. El análisis de enriquecimiento de células inmunes (MIXTURE), demostró que estos tumores exhiben un menor infiltrado de células T CD8+ citotóxicas y una mayor frecuencia de macrófagos inmunosupresores con fenotipo M2. Finalmente, debido a que los tumores producen cantidades sustanciales de Gal1 que se libera al medio extracelular a través de una vía no tradicional y aún desconocida, presumimos que Gal1 podría externalizarse en exosomas, contribuyendo así a la inmunosupresión a distancia y específica de tejido. Observamos que exosomas CD63+ purificados a partir de células de cáncer de mama murino triple negativo 4T1 y humano HER2+ JIMT-1 contenían altos niveles de Gal1. Además, Gal1 colocalizó con el marcador de exosomas CD63 y luego de la lisis de los mismos, detectamos niveles más altos de Gal1 en el medio extracelular (ME). La inhibición de la esfingomielinasa neutra, una enzima clave en la vía de liberación del exosomas, por GW4869 disminuyó el contenido de Gal1 en el ME. La adición de exosomas Gal1+ (y no aquéllos derivados de células Gal1 KO), inhibió la proliferación in vitro de células T CD4+ y CD8+ y disminuyó la expresión de Gzmb e IL-2 en células T CD4. Nuestros datos demuestran que Gal1 es secretada a través de exosomas derivados de células de cáncer de mama presentando capacidad inmunosupresora sobre células T. En resumen, nuestros resultados en conjunto demuestran la relevancia de Gal1 en la glándula mamaria normal, y enfatizan su rol crítico en la diseminación metastásica e inmunosupresión a distancia en cáncer de mama. En base a nuestros datos experimentales usando modelos murinos y humanos, y validados desde el punto de vista clínico, proponemos a la dupla génica LGALS1/ST6GAL1 como posible biomarcador capaz de predecir la sobrevida de pacientes en cáncer de mama humano y como un posible blanco terapéutico de nuevas terapias antimetastásicas.