Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales - Chamorro, María Eugenia (2014)
La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producciónde células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir delhallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo elnervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cualestaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el usofarmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, seintensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad quemerece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuoslisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales deexperimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividadneuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferentefunción evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento depacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadasen la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizóun modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar,en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayosparalelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médulaósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide,tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562,independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origenneuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante,utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones decianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo conrespecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína porcarbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye elobjetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron unasignificativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular porapoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferacióncelular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollode unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células demédula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquinaproinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a lainducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina encélulas neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías deseñalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultadosconfirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad paramantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroidepero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividadsimilar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en lascélulas SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a travésdel receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por unasubunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad delreceptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßcpara prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar sucapacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de célulaseritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización quejuegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien encultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2,primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad decEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lohace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo laexpresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, elarresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferacióncelular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización poraumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad deuna fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación dela señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B essignificativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estarasociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. Lacolocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasadesfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, enconsecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la accióndiferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides.