Endocitosis rápida en células cromafines de ratón : mecanismos asociados, su regulación por Ca2+ y su participación en el reciclado vesicular

• Autores: Belingheri, Ana Verónica
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Marengo, Fernando Diego
• Materia: ENDOCITOSIS RAPIDA; CA2+; EXOCITOSIS; CLATRINA; DINAMINA; KISS AND RUN; BULK ENDOCITOSIS; RAPID ENDOCYTOSIS; CA2+; EXOCYTOSIS; CLATHRIN; DYNAMIN; KISS AND RUN; BULK ENDOCYTOSIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En las células cromafines se han descripto varios tipos de endocitosis (clatrinadependiente, kiss and run, bulk endocitosis), las cuales contribuyen a la recuperación y elreciclado de la membrana plasmática, de sus proteínas, y de las vesículas que se hanfusionado por exocitosis. En esta Tesis doctoral se ha medido electrofisiológicamente laendocitosis rápida en células cromafines de ratón, observándose dos modalidades. Por unlado, una endocitosis compensatoria que evoluciona con una única constante temporalrápida de ~8 seg, e internaliza aproximadamente la misma cantidad de membrana que fueexocitada durante la estimulación. Esta modalidad se dispara en respuesta a una entrada de Ca2+ menor a 79 pC (grupo LCG, por “low current group”). Por otro lado, se identificó unaendocitosis en exceso que internaliza una cantidad de membrana mayor a la exocitadapreviamente, evolucionando con dos constantes temporales, una rápida de cinética similara la del LCG y una ultra-rápida de ~0,6 seg. Esta última modalidad es disparada por unaentrada de Ca2+ mayor a 79 pC (grupo HCG, por “high current group”). Por medio de lautilización de fármacos específicos, se demuestra en esta Tesis que la endocitosis rápidadepende específicamente tanto de la entrada de Ca2+ a través de canales dependientesde voltaje (CCDV) de tipo L como del Ca2+ liberado desde el retículo endoplasmático. Además, la utilización de BAPTA demostró que la endocitosis rápida sería dependiente deuna señal de Ca2+ localizada. Por otro lado, dos inhibidores del reclutamiento de clatrinainhibieron totalmente la endocitosis en el grupo LCG, y parcialmente en el grupo HCG. Esto sugiere que en este último grupo, se activaría un mecanismo clatrino-independiente. En HCG ambos componentes cinéticos se vieron afectados por los inhibidores de clatrina,sugiriendo que cuando la entrada de Ca2+ es muy alta la endocitosis clatrina-dependientepuede evolucionar a velocidades aún no reportadas en la literatura. Finalmente,experimentos de imaging con FM1-43 mostraron que la endocitosis en exceso inducidapor una despolarización con alto K+ se compone de una fracción reciclable a vesículasliberables y de otra no reciclable en un período de 30 minutos, siendo la primera inhibidaparcialmente por un bloqueante del reclutamiento de clatrina. Estos resultados en suconjunto nos permiten sugerir un modelo en el cual: (a) la entrada localizada de Ca2+ por CCDV tipo L induce la liberación de más Ca2+ del retículo endoplásmico. (b) Elconsecuente aumento de este catión induce la activación de una endocitosis clatrinadependiente, que debido a su Ca2+ dependencia se muestra muy rápida al comienzomientras el Ca2+ alto persiste en el citosol, y más lenta luego de que la concentracióncitosólica del catión ha disminuido. Esto explicaría la clatrino dependencia de amboscomponentes. (c) Esta endocitosis clatrina dependiente resulta parcialmente en lageneración de nuevas vesículas liberables. (d) La gran entrada de Ca2+ en el grupo HCGinduciría además la activación de un proceso clatrina independiente, que no se recicla envesículas liberables en los tiempos del experimento.
Chromaffin cells have various types of endocytosis (clathrin-dependent, kiss and run, bulkendocytosis), which allow the recovery and recycling of membrane and proteins of thepreviously fused vesicles. We measured two modes of rapid endocytosis in mousechromaffin cells. On one hand, compensatory endocytosis (compensates approximatelythe same amount of membrane that was added during stimulation) is associated with a Ca2+ entry lower than 79 pC (LCG group) and a single time constant of ~8 sec. On theother hand, excess retrieval (the endocytosis surpasses the amount of the previouslyexocytosed membrane), is triggered by a Ca2+ entry bigger than 79 pC (HCG group) andhas two time constants, a fast one (~8 sec) and an ultrafast one (~0,6 sec). The results ofthis Thesis show that the activation of rapid endocytosis is dependent on a localized Ca2+signal, and specifically depends on Ca2+ influx through L-type voltage dependent Ca2+channels (VDCC) and Ca2+ released from the endoplasmic reticulum. Additionally, wefound that rapid endocytosis is clathrin dependent, almost entirely for the LCG group, andpartially for the HCG group. Particularly in HCG, it is interesting that clathrin specificblockers inhibited the fast, but also the ultrafast component, what suggests that clathrindependent endocytosis can progress at rapid speeds not previously reported when the Ca2+ entry is very big. The electrophysiological study on endocytosis was complementedwith experiments of imaging using the membrane fluorescent probe FM1-43. After applyinga high K+ depolarization that allows a large Ca2+ influx, we recorded an endocytosis thatsurpassed the previous exocytosis. We found that the internalized membrane was partiallyrecycled to releasable vesicles, by a mechanism that is at least in part clathrin dependent. There was also a large internalized membrane fraction which was not releasable during theexperimental period. We propose a tentative model in which: (a) Ca2+ entry through L-type VDCC triggers the release of more Ca2+ from endoplasmic reticulum; (b) the resultingincrease of Ca2+ activates a rapid clathrin dependent endocytosis, and particularly in HCGthe higher Ca2+ concentration during the first hundreds of milliseconds after the stimulusprovokes the appearance of the ultrafast component; (c) clathrin dependent endocytosispartially results in the generation of new releasable vesicles in less than 30 min; (d) in HCG, the high Ca2+ entry also provokes the activation of a clathrin independentendocytosis that does not produce releasable vesicles in the experimental period.
Fil: Belingheri, Ana Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.