La entrada del virus dengue 3 y sus implicancias en la actividad antiviral

• Autores: Piccini, Luana Erica
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Damonte, Elsa Beatriz; Castilla, Viviana
• Materia: VIRUS DENGUE; ENTRADA VIRAL; ENDOCITOSIS; CLATRINA; ENDOCITOSIS NO CLASICAS; INFECCION MEDIADA POR ANTICUERPOS; TRAFICO INTRACELULAR; VIRUS DE PENETRACION TARDIA; CARRAGENANOS; ACTIVIDAD ANTIVIRAL; DENGUE VIRUS; VIRAL ENTRY; ENDOCYTOSIS; CLATHRIN; NON-CLASSICAL ENDOCYTOSIS; ANTIBODY-MEDIATED INFECTION; INTRACELLULAR TRAFFIC; LATE PENETRATING VIRUS; CARRAGEENAN; ANTIVIRAL ACTIVITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad.
The reemergence of dengue virus (DENV) in the last decades is a serious threat for public health, since at present almost half the world population is at risk of infection. Instead of the increasing DENV incidence worldwide, and particularly in America, there is no specific chemotherapy for treatment of the disease. The initial stages leading to virus entry into the host cell represent an attractive antiviral strategy for chemotherapy to suppress the beginning of infection. However, DENV entry appears to be a very complex process regulated by several celland virus-dependent factors that may also affect antiviral susceptibility to agents blocking the initial virus-cell interaction. The aim of the present study was to study the entry of dengue 3 (DENV-3) into mammalian cells and the possible relationship with antiviral susceptibility, analyzing the inhibitory action of carrageenans. By using chemical and molecular inhibitors of different endocytic pathways, it was demonstrated that the infectious entry of DENV-3 strain H87 into Vero and A549 cells occurs by a non-classical clathrin-independent endocytosis pathway, which depends on the acid endosomal pH and dynamin, and is partially-mediated by caveolae. Results show for the first time in these cell systems the simultaneous coexistence of infective and non-infective routes for DENV entry into the cell, a phenomenon that may reduce the efficiency of infection. The intracellular trafficking of DENV-3 after uptake was typical of a late-penetrating virus to achieve fusion and viral uncoating. The influence of the clathrin pathway in DENV-3 infective entry in other mammalian cell lines of human origin, such as HepG2, U937 and K562 cells, was also evaluated demonstrating that variable entry pathways are employed depending on the host cell. Furthermore, the entry into U937 cells also when infection occurred in the presence of non neutralizing antibodies. Next, the antiviral susceptibility of DENV-3 to entry inhibitors was evaluated. Both λ and ι carrageenans were potent inhibitors of DENV-3, with selective index values (ratio cytotoxicity / antiviral activity) higher than 1000. However, no inhibition was detected in antibody-mediated infection. The target of these compounds was virus entry by dual blockade of virus adsorption and internalization of the nucleocapsid from the endosomes. The characterization of the entry pathway of DENV-3 and the antiviral activity of compounds that block early events in virus multiplication cycle provides information to elucidate the mechanisms responsible of virus infection as well as to optimize the design of new antiviral therapies protective against the four DENV serotypes, in order to prevent progression to severe and lethal forms of disease.
Fil: Piccini, Luana Erica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.