Inhibición del crecimiento tumoral utilizando estrategias antisentido en un modelo experimental de carcinogénesis mamaria

• Autores: Salatino, Mariana
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elizalde, Patricia Virginia
• Materia: CANCER DE MAMA; PROGESTAGENOS; IGF-IR; ESTRATEGIA ANTISENTIDO; INMUNOTERAPIA; BREAST CANCER; PROGESTINS; IGF-IR; ANTISENSE STRATEGIES; IMMUNOTHERAPY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El receptor de factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-IR) pertenece a la familia de los receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo II, su ligando más afín es el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y es un factor clave en el desarrollo y la progresión del cáncer. Está demostrado que el IGF-IR es un requerimiento absoluto para el establecimiento y mantenimiento del fenotipo transformado, no siéndolo para el crecimiento de células normales, por lo que se lo considera un blanco ideal en la terapia antitumoral. Previamente demostramos que el bloque in vitro de la expresión del IGF-IR, utilizando oligodeoxinucleótidos antisentido (ASODN) al ARNm del IGF-IR, resultó en la inhibición de la proliferación mediada por el acetato de medroxiprogesterona (progestágeno sintético) de células C4HD pertenecientes a un tumor mamario murino progestágeno-dependiente. El objetivo del presente trabajo fue inhibir in vivo el crecimiento del tumor mamario C4HD empleando dos estrategias antisentido diferentes. En la primera estrategia, demostramos que la administración diaria intratumoral o sistémica en ratones hembra BALB-c de un ASODN fosfotiolado (AS[S]ODN) al IGF-IR resultó en la inhibición del crecimiento in vivo del tumor C4HD. El tratamiento indujo una disminución significativa en el volumen tumoral y en la velocidad de crecimiento, sin observarse ningún signo de toxicidad en los ratones tratados. El efecto antitumoral fue específico debido a su dosis-dependencia y a la falta de efecto en ratones tratados con [S]ODN sentido. Dado que la activación del IGF-IR resulta en la estimulación de varias cascadas intracelulares, incluyendo la vía de las proteínas quuinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la vía de la fosfatidil-inositol-3-quinasa/Akt (PI-3K/Akt), decidimos estudiar que vías estaban afectadas por el bloqueo in vivo de la expresión de IGF-IR. Los tumores obtenidos de ratones tratados con AS[S]ODN mostraron disminución en la expresión y fosforilación del IGF-IR y en la fosforilación del sustrato del receptor de insulina-1, inhibición de la activación de PI-3K/Akt y p42/p44MAPK. Más aun, la inhibición in vivo de la expresión del IGF-IR resultó en la inhibición de la fosforilación del ErbB-2 y del ErbB-3 (RTK tipo I) y la inhibición de la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3, demostrando in vivo la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y los ErbBs. Sin embargo, no encontramos regulación en la expresión y/o activación del receptor de progesterona inducida por el tratamiento in vivo con el AS[S]ODN. Por otra parte, numerosas evidencias indican que el efecto antitumoral del bloqueo de la expresión del IGF-IR involucra también una respuesta inmune del huésped. Por lo tanto en la segunda estrategia experimental, evaluamos la capacidad que tiene la inoculación de células tumorales C4HD tratadas con AS[S]ODN al IGF-IR para proteger de un posterior desafío tumoral y estudiamos la respuesta inmune desencadenada. Para ello, se inyectaron repetidamente ratones hembra BALB-c con células del tumor C4HD tratadas in vitro con el AS[S]ODN e irradiadas y se desafiaron luego con el tumor C4HD. La inmunización con células tratadas con el AS[S]ODN indujo una inhibición significativa del crecimiento del tumor C4HD con respecto a los tumores de los grupos controles. El efecto antitumoral resultó ser específico para el tumor C4HD, pues no se observó protección cuando se desafió con los tumores mamarios singeneicos 60HI o LM3. La inmunización en ratones nude no inhibió el crecimiento del tumor C4HD demostrando la dependencia de linfocitos T en el efecto protector. Además, no se detectaron anticuerpos específicos contra el tumor en los sueros de los ratones inmunizados, por lo que se descartó una respuesta de tipo humoral. Mediante ensayos de hipersensibilidad retardada, citotoxicidad por liberación de 51Cr y proliferación de esplenocitos, se confirmó que la inoculación de células tratadas con el AS[S]ODN desencadenó una respuesta inmune de tipo celular. Mediante un ensayo de citotoxicidad, previa depleción selectiva de las poblaciones de linfocitos T CD4+ o CD8+, se demostró que el efecto citotóxico era CD8+-dependiente. La inmunización provocó también la inducción de la producción de IFN-γ por los esplenocitos al ser enfrentados con el tumor, induciendo, a la vez, la lisis de las células tumorales por activación de la vía de muerte de Fas. El aumento de antigenicidad inducido por el tratamiento de las células tumorales con el AS[S]ODN al IGF-IR estuvo acompañado con un aumento en la expresión de la proteína chaperona de péptidos Hsp70 y de la molécula coestimuladora CD86. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que el crecimiento de un tumor mamario puede ser inhibido tanto por la administración directa in vivo de AS[S]ODN al IGF-IR, o a través de la inducción de una respuesta inmune protectora al inyectar inmunógenos derivados de células tumorales tratadas con el AS[S]ODN al IGF-IR.
The insulin-like growth factor receptor (IGF-IR) belongs to the family of transmembrane protein tyrosine kinases (RTK) type II, binds with high affinity the ligand-like growth factor type I and plays a key role in cancer development and progression. It has been shown to be an absolute requirement for the establishment and maintenance of the transformed phenotype but not for normal cells, what makes it an attractive target for cancer therapy. Previously, we had demonstrated that treatment of C4HD cells, from a progestin-dependent mammary tumor model, with antisense oligodeoxinucleotides (ASODN) to IGF-IR mRNA resulted in a complete abrogation of in vitro medroxiprogesterone acetate (synthetic progestin) induced proliferation. In the present study we addressed the effect of targeting IGF-IR with antisense strategies, in in vivo growt of C4HD tumors from the same experiental model. We employed two different experimental strategies. With the first strategy we demonstrated that either direct intratumor injection, or systemic administration of phosphorothioate antisense oligodeoxinucleotides (AS[S]ODN) to IGF-IR mRNA, resulted in significant inhibition of C4HD tumor growth. The antitumor effect of IGF-IR AS[S]ODN in both experimental protocols was due to a specific antisense mechanism, since growth inhibition was dose-dependent and no abrogation of tumor proliferation was observed in mice treated with phosphorothioate sense ODNs (S[S]ODNs). In addition, IGF-IR expression was inhibited in tumors from mice receiving AS[S]ODN, as compared to tumors from control groups. No signs of toxicity were detected in any treated-mice. We then investigated signal transduction pathways modulated in vivo by AS[S]ODN treatment. Tumors from AS[S]ODN-treated mice of both intratumoral and intravenous protocols, showed a significant decrease in the degree of insuline receptor substrate-1-tyrosine phosphorylation. Activation of two of the main IGF-IR signaling pathways, phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/Akt pathway and p42/p44 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, was abolished in tumors growing in AS[S]ODN-treated animals. Moreover, ErbB-2 and ErbB-3 (RTK type I) tyrosine phosphorylation was blocked by in vivo administration of AS[S]ODN. On the other hand, we found no regulation of either progesterone receptor expression or activity by in vivo AS[S]ODN administration. In the second experimental strategy, we explored whether inhibition of breast cancer growth could be achieved by activation of a host´s immune response through administration of breast tumor immunogens obtained by in vitro treatment of tumor cells with IGF-IR AS[S]ODN. We demonstrated that serial injection of IGF-IR AS[S]ODNs-treated C4HD cells provided protection against C4HD wild-type tumor challenge in vivo. The protective effect was C4HD-specific since no protection was observed when immunized mice were challenge with the singeneic mammary tumor lines 60HI or LM3. Immunization of nude mice did not prevent C4HD tumor formation suggesting that T lymphocytes were involved in the antitumor effect. In addition, tumor specific antibodies were not found in serum collected from mice immunizated with AS[S]ODN treated cells, indicating that a humoral response was not involved. Delayed type hypersensitivity, citotoxicity and splenocytes proliferation assays demonstrated that a cellular immune response was responsible for the antitumor effect induced by immunization with AS[S]ODN treated cells. Moreover, we found that cytotoxic effect against tumor cells was CD8+-dependent. Immunization also induced splenocytes to produce antigen-dependent IFN-γ, and to kill tumor cells by a mechanism that involved the activation of Fas death pathway. Induction of immunogenic phenotype in C4HD cells after treatment with AS[S]ODN, occurred along with the induction of the expression of peptide-chaperone protein Hsp70 and the costimulatory molecule CD86. In conclusion, our results demonstrated, for the first time, that breast cancer growth can be inhibited either by direct in vivo administration of IGF-IR AS[S]ODN, or through induction of a protective immune response in vivo with tumor immunogens derived from IGF-IR AS[S]ODN-treated breast tumor cells.
Fil: Salatino, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.