Biosíntesis de protoporfirina 9 en glándula de Harder : a)Estudios de las etapas enzimáticas b)Purificación y propiedades de la delta Ala dehidratasa - Tomio, Josefina María (1970)
El estudio del pigmento presente en la glándula de Harder de ratas blancas,demuestra que es una mezcla de porfirinas cuyo componente principales protoporfirina, pero que contiene en cantidades mucho menores una porfirina tricarboxílica y coproporfirina de la serie isomérica III. La concentración de porfirinas en la glándula de animales adultos es de 0,15 µg por mg de tejido fresco. Se demuestra la presencia de todas las enzimas relacionadas con la biosíntesis de la protoporfirina 9, lo que avala la naturaleza secretora de porfirinas de esta glánflula. Se estudian además algunas propiedades de los sistemas catalíticos. La δ-ALA sintetasa, primera enzima de esta secuencia, está localizada enlas mitocondrias. Utiliza como sustratos glicocola y succinil-CoA, siendo cofactores necesarios de la reacción fosfato de piridoxa], ATP, Mg(++) y aerobiosis. Diferentes condiciones ensayadas para obtener mayor actividad demuestranque es fundamental un pretratamiento de las partículas mitocondriales con agentes quelantes y sulfhidrílicos. El producto de la reacción inhibe la actividad catalítica de la sintetasa. La segunda enzima de este camino, la δ-ALA dehidratasa, se encuentra enla fracción citoplasmática, no asociada a partículas subcelulares. Se logra purificarla unas 150 veces respecto del extracto crudo, la que se comporta como homogénea en diferentes corrilas electroforéticas. Se establece su naturaleza sulfhidrílica, presentando actividad máximaen anaerobiosis. Es estable al calor, su acción es óptima en buffer fosfatoa pH 6,8 y a temperaturas más altas que las fisiológicas (55°C). No se determina requerimiento de metales pero es inhibida fuertementepor EDTA. Sus propiedades cinéticas la incluyen dentro de las actividades de las otrasδ-ALA dehidratasas de origen animal, y no justifican la acumulación deprotoporfirina presente en este órgano, por un incremento excesivo de su actividad catalítica. El complejo porfobilinogenasa-Uro'gen sintetasa y cosintetasa- es también "soluble". Se detectan ambas actividades y se comprueba la labilidad del sistema sintetizante de Uro'gen III, ya sea por precalentamiento del sistema como por estudios de estabilidad. El sistema descarboxilante de los porfirinógenos, que lleva a coproporfirinógeno III, está en el sobrenadante de mitocondrias y es inestable al calor. Se detectan en esta etapa todos los intermediarios conocidos de la cadenabiosintética, es decir, los porfirinógenos que poseen 7-, 6-, 5- y 4-CO0H. La coprogenasa, sistema que sintetiza el último de los intermediariostetrapirrólicos comunes a los caminos divergentes de hemo, proteínas y clorofilas - la protoporfirina 9 - se encuentra localizada en mitocondrias y requiere oxígeno para su actividad. Todos estos resultados demuestran la biosíntesis "de novo" de la proto 9en la glándula de Harder de rata a partir de sus precursores primarios, la presencia de todos y cada uno de los sistemas enzimáticos relacionados, y, por ende, la existencia de una funcionalidad similar a la de otros sistemas de vida.