Proteolisis en hojas senescentes de trigo : identificación y caracterización de proteasas inducidas durante la senescencia foliar

• Autores: Roberts, Irma Natalia
• Año de publicación: 2005
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Barneix, Atilio José
• Materia: PROTEOLISIS; PROTEASAS; SENESCENCIA; RUBISCO; TRIGO; PROTEOLYSIS; PROTEASES; SENESCENCE; RUBISCO; WHEAT
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La senescencia es la última etapa del desarrollo de todo órgano vegetal. Uno de sus eventos más característicos es el aumento en la tasa de proteólisis. El objetivo del presente trabajo fue identificar algunas de las enzimas responsables de la proteólisis asociada a la senescencia y definir su grado de participación en este proceso. La senescencia se indujo por incubación en oscuridad de hojas cortadas de plantas de trigo de 15 d. La actividad endoproteolítica, medida por hidrólisis de azocaseína, en extractos preparados a partir de dichas hojas, aumentó un 400% al cabo de 4 d de incubación. Cuando un extracto de hojas senescentes se fraccionó por cromatografía en columna de DEAESepharosa, la actividad azocaseinolítica se dividió en dos picos, denominados P1 y P2. P1 se purificó e identificó como una serín proteasa tipo subtilisina. Esta enzima aparece en hojas senescentes inducidas por incubación en oscuridad pero no por deficiencia de N. P2 se purificó en forma parcial y su caracterización bioquímica reveló que también pertenece al grupo de las serín proteasas. A diferencia de P1, P2 ya está presente en hojas no senescentes y se induce no sólo por oscuridad sino también por hambreado de N. P2 aparece principalmente en la fracción extracelular, mientras que P1 sólo se encuentra en la fracción intracelular de hojas senescentes. Estos resultados indican que a pesar de las similitudes bioquímicas y estructurales, estas enzimas deben estar involucradas en diferentes funciones biológicas. La actividad del proteasoma 20S en extractos de hojas senescentes se mantuvo constante hasta los 4 d de incubación. Tampoco se observaron cambios en los niveles de proteína de proteasoma 20S ni de proteínas ubiquitinadas. Estos resultados indican que la vía ubiquitina-proteasoma se conserva activa hasta las etapas más tardías de senescencia, probablemente ligada a funciones regulatorias y mantenimiento de la viabilidad celular.
Senescence is the last developmental stage of every plant organ. Among other events, this process is characterized by a high rate of protein degradation. The aim of the present work was to identify some of the enzymatic activities involved in senescence-associated proteolysis and to discern the extent of their participation in this process. Senescence was induced in detached leaves from 15 d-old wheat plants by incubation in darkness. Endoproteolytic activity measured as azocasein hydrolysis was determined in extracts prepared from these leaves. After 4 d in darkness., azocaseinolytic activity showed an increased of 400%. When an extract prepared from senescent leaves was fractionated on a DEAESepharose column, the azocaseinolytic activity could be divided in two major peaks, named P1 and P2. P1 was purified and identified as a subtilisin-like serine endoprotease. This enzyme appears in senescent leaves induced by incubation in darkness but was not detectable in leaves induced to senescence by N deprivation. P2 was partially purified and also characterized as a serine protease. This protein was already present in non-senescent leaves and its signal increases in leaves induced by darkness as well as by N starvation. P2 appeared mainly in the extracellular fraction while P1 was only found in the intracellular fraction of senescent leaves. These results indicate that despite the biochemical and structural similarities between these two enzymes, they must be implicated in different biological functions. Chymotrypsin-like activity of proteasome 20S remained constant until 4 d of incubation in darkness. Also, the amount of 20S proteasome protein and of ubiquitinated proteins did not change. These results indicate that the ubiquitin-proteasome pathway remains functional until late phases of senescence likely participating in regulatory aspects of the senescence process and maintaining of cell viability.
Fil: Roberts, Irma Natalia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.