Prospección y caracterización de bacterias celulolíticas y hemicelulolíticas

• Autores: Ghio, Silvina
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Campos, Eleonora; Grasso, Daniel H.
• Materia: PAENIBACILLUS SP. A59; ENDOXILANASAS; GH10; GH11; BIOMASA LIGNOCELULOSICA; SUELOS FORESTALES; PAENIBACILLUS SP. A59; ENDOXYLANASES; GH10; GH11; LIGNOCELLULOSIC BIOMASS; FOREST SOILS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La prospección de bacterias con capacidad de degradar lignocelulosa permite laidentificación de nuevas enzimas con potencial aplicación en numerosos procesosindustriales. En este trabajo el objetivo fue la obtención de enzimas con aplicaciónpotencial en la bioconversión de lignocelulosa, mediante la prospección de bacteriascelulolíticas de suelos forestales nativos y estudiar sus mecanismos dedeconstrucción de biomasa. Se obtuvieron consorcios bacterianos celulolíticos dedos localidades de Argentina (Cerro Bayo, Neuquén y Valle Grande, Mendoza). Losconsorcios fueron caracterizados en cuanto a su actividad enzimática, siendo elconsorcio CB1-2 el que presentó mayor actividad celulolítica relativa. A partir delmismo se logró el aislamiento de todos sus integrantes y uno de ellos, al que sedenominó Paenibacillus sp. A59, resultó el principal responsable de la actividadestudiada, mientras que los aislamientos pertenecientes a los géneros Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp. y Bacillus sp. no presentaron actividadcelulolítica detectable. Por técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) sesecuenció el genoma completo de Paenibacillus sp. A59 con una profundidad de 110veces y se ensambló en 83 contigs. A partir del análisis del genoma con múltiplesherramientas bioinformáticas, como las plataformas del NCBI, RAST y dbCAN,seguido de depuración manual, se identificaron 82 secuencias codificantes parapotenciales proteínas activas sobre carbohidratos, incluyendo celulasas, xilanasas,mananasas, quitinasas y amilasas, entre otras. Además, se determinaron lascondiciones óptimas para maximizar la actividad enzimática en el sobrenadante decultivo, utilizando como fuente de carbono carboximetilcelulosa, xilano o residuo decosecha de caña de azúcar, resultando predominante la actividad xilanasa encrecimiento con xilano. El estudio del secretoma en las diferentes condiciones decultivo ensayadas, permitió identificar las proteínas responsables de dicha actividady establecer un posible modelo para el sistema xilanolítico de esta bacteria. Entre lasenzimas identificadas, dos endoxilanasas de las familias GH10 y GH11 involucradasen la deconstrucción de la hemicelulosa, fueron seleccionadas para ser expresadasde manera recombinante y caracterizar su actividad. Ambas enzimas se expresaronen el sistema de E. coli, de manera soluble y fueron purificadas a homogeneidad. Presentaron actividad óptima a temperaturas moderadas (entre 40 y 55°C) y a pHs cercanos al neutro, si bien rGH11XynB presentó también alta actividad a pH alcalino. Tanto rGH10XynA como rGH11XynB mostraron actividad xilanolítica sobre xilanoscomerciales y sobre la fracción hemicelulolítica de biomasas pre-tratadas (trigo,cebada y maíz). Sin embargo, la cinética enzimática y el perfil de los productos dehidrólisis generados mostraron diferencias, lo que podría determinar su utilización enuna variedad de procesos. Este estudio comprende un análisis detallado delaislamiento Paenibacillus sp. A59 y de sus enzimas activas sobre carbohidratos,contribuyendo así en la comprensión de los mecanismos microbianos involucradosen la bioconversión de polisacáridos y estableciendo las bases para su aplicaciónindustrial.
Prospection of hemicellulose degrading bacteria allows the identification of novelenzymes with potential application in numerous industrial processes. The objective ofthis work was the obtention of enzymes with potential application in bioconversion oflignocellulose, by prospection of cellulolytic bacteria from native forest soils, and thestudy of their mechanisms of biomass deconstruction. We obtained cellulolyticbacterial consortia from forest soils, from two areas of Argentina (Cerro Bayo, Neuquén and Valle Grande, Mendoza). Enzymatic activity of the consortia wascharacterized, resulting CB1-2 the one with the highest relative cellulolytic activity. We isolated all the consortium components and one of them, Paenibacillus sp. A59,was the main one responsible for the assayed activity, while the isolates belonging to Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp. and Bacillus sp. did not present cellulolyticactivity. By next generation sequencing (NGS) techniques, Paenibacillus sp. A59genome was fully sequenced, with a 110-fold coverage, and assembled in 83contigs. By genome analysis using multiple bioinformatic tools, such us NCBI, RASTand dbCAN pipelines followed by manual editing, 82 coding sequences for potentialcarbohidrate active enzymes were identified, including cellulases, xylanases,mannanases, chitinases and amylases, among others. Also, optimal conditions forachieving the highest enzymatic activity in culture supernatants were determined,using carboxymethylcellulose, xylan or sugarcane straw as carbon sources, resultingxylanase the main activity, by growth in xylan. Secretome study under the differentculture conditions assayed, allowed to identify the main proteins responsible for theactivity and to establish a possible model of the xylanolytic system of this bacterium. Among the enzymes identified, two endoxylanases from GH10 and GH11 families,involved in hemicellulose deconstruction, were selected for recombinant expressionand activity characterization. Both enzymes were expressed in E. coli system in thesoluble fraction and purified to homogeneity. They presented optimal activity atmoderate temperatures (between 40°C and 55°C) and at neutral pH, andrGH11XynB showed also high activity at alkaline pH. rGH10XynA and rGH11XynBhad xylanolytic activity on comercial xylans and on the hemicellulolytic fraction of pretreatedbiomasses (wheat, barley and maize). However, the enzyme kinetics and thehydrolysis products profiles showed differences, which could determine theirutilization in a variety of processes. This study comprises a detailed analysis of Paenibacillus sp. A59 isolate and their carbohydrate active enzymes, contributing tothe understanding of microbial mechanisms involved in polysaccharidesbioconversion and setting the basis for industrial application.
Fil: Ghio, Silvina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.