Prevención y tratamiento de Rotavirus A mediante nanoanticuerpos VHH anti-VP6 - Maffey, Lucía (2016)
La diarrea asociada a Rotavirus A (RVA) representa una de las principales causas de mortalidad infantil a nivel mundial. Si bien la vacunación masiva contra RVA ha logrado disminuir significativamente las muertes causadas por este patógeno, la disponibilidad y la eficacia de las vacunas en zonas de bajos recursos es limitada. Por otra parte, el manejo clínico de la infección por RVA se basa en la administración de Sales de Rehidratación Oral (SRO), mientras que las opciones terapéuticas específicas resultan limitadas. El principal objetivo de este trabajo fue estudiar y optimizar la utilización de dos fragmentos correspondientes a la porción variable de anticuerpos de cadena pesada derivados de llama (VHH) dirigidos contra la proteína VP6 – 2KD1 y 3B2– para la prevención y el tratamiento de la diarrea asociada a RVA y comparar su eficacia respecto de otras opciones terapéuticas disponibles. En primer lugar, se analizó la eficacia de ambos clones de VHH anti-VP6 para laprevención y el tratamiento de la diarrea inducida por RVA en un modelo de ratón (BALB/c)lactante inoculado con una cepa virulenta de RVA murino (EcW, G16P[16]I7). En el tratamientoprofiláctico, los VHH fueron administrados oralmente dos horas antes de la inoculación viralmientras que en el tratamiento terapéutico, los VHH fueron administrados oralmente luego de la inoculación viral, tanto en forma previa a la aparición de los síntomas (pre-sintomático) como luegode la ocurrencia de diarrea (post-sintomático). En todos los casos, ratones lactantes de cuatro díasde vida fueron inoculados con 1778 DD50 (Dosis Diarrea 50) de RVA murino a los 0 Días Post Inoculación (DPI) y examinados diariamente para determinar la ocurrencia de diarrea y recolectar muestras de heces. Los ratones tratados y el control no tratado fueron sacrificados en forma secuencial entre los 0 y los 6 DPI para el tratamiento profiláctico y los 0 a 7 DPI en el caso de los tratamientos terapéuticos pre y post-sintomáticos. Luego de la eutanasia, se colectaron muestrasde intestinos y de suero. 1. Ensayos profilácticos. Se evaluó la eficacia de dos dosis de VHH, utilizando cuatro camadas de ratones lactantes para cada tratamiento diario: 160 μg de 2KD1+3B2 (N = 31) y 200 μg de 2KD1+3B2 (N = 30). En ambos casos, el tratamiento comenzó a los -1 DPI ycontinuó hasta los 6 DPI. En el DPI 0, los VHH fueron administrados dos horas antes de la inoculación viral. Los controles incluidos fueron ratones inoculados no tratados (control no tratado)y ratones no inoculados (control normal). 2. Ensayo terapéutico pre-sintomático. Se evaluaroncuatro tratamientos orales: 160 μg de 2KD1+3B2 (80 μg de cada uno) (N = 25), 200 μg de 2KD1+3B2 (100 μg de cada uno) (N = 28), 200 μg de 3B2 (N = 24), 200 μg de 2KD1 (N = 30). Paraambos ensayos, se determinó también la presencia de anticuerpos anti-RVA en muestras desueros e intestino a los 0, 7 y 40 DPI. Asimismo, se evaluó el surgimiento de una respuesta inmunehumoral contra el tratamiento de VHH por medición de anticuerpos anti-VHH intestinales y séricosa esos tiempos y el posible surgimiento de mutantes virales de escape al tratamiento mediante PCR, secuenciación completa y análisis filogenéticos del gen codificante de VP6 en muestras de intestinos y heces positivas para RVA luego de 4-6 días de tratamiento. Los resultados obtenidos mostraron que ambas dosis profilácticas de 2KD1+3B2 redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea al igual que el título infeccioso enintestino y la excreción viral en heces. En relación al tratamiento terapéutico pre-sintomático, laadministración conjunta de 2KD1 y 3B2 (200 μg) redujo significativamente la duración y severidadde la diarrea, la infección intestinal y la excreción fecal en relación al grupo no tratado. Mientras que la misma dosis de 2KD1 o 3B2 (200 μg) también redujo la duración de la diarrea por RVA conrespecto al control, 2KD1 resultó más efectivo en la disminución de la infección intestinal y la excreción de RVA en heces. Si bien ambos clones presentaron amplia actividad neutralizantecontra diferentes cepas de RVA in vitro, el clon 2KD1 requirió menores concentraciones que 3B2para neutralizar algunas variedades, en particular la cepa de RVA murino usada en los ensayosprevios. Asimismo, 2KD1 presentó valores de afinidad por las partículas de RVA tres veces mayorque 3B2 (EC50). Ni el tratamiento profiláctico ni el tratamiento terapéutico pre-sintomático con VHHanti-VP6 interfirieron con la respuesta inmune humoral del hospedador frente a RVA. Tampoco sedetectaron mutantes virales de escape al tratamiento a nivel de la proteína VP6 en ningún caso. Tratamiento terapéutico post-sintomático. En este caso, los ratones fueron inoculados con 1778 DD50 de RVA murino al cuarto día de vida como ya fuera descripto y recibieron un tratamientodiario de 200 μg de 2KD1 a partir de los 2 DPI, cuando todos los ratones presentaban diarrea,hasta los 7 DPI. El tratamiento terapéutico post-sintomático con 200 μg de 2KD1 redujo la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en relación al control no tratado. Aunque hubo una tendencia a reducir la duración de los síntomas, las diferencias no fueron significativas. Con el objetivo de evaluar la prevención de la diarrea por RVA en un modelo deadministración continua de los VHH, se realizó un nuevo ensayo involucrando ratonas transgénicas que expresaban los VHH anti-VP6 (2KD1+3B2) en leche materna, regulados bajo el promotor del Virus de Tumor Mamario Murino. En este caso, los ratones fueron inoculados a los cuatro días devida con una dosis menor de RVA murino (800 DD50) y se utilizaron cuatro camadas de ratonestransgénicos amamantados por madres transgénicas y cuatro camadas de ratones wild type amamantados por madres wild type como control. Para descartar que la transgénesis de los ejemplares pudiera tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad por RVA, se efectuó unensayo de cross-fostering en el cual las progenies de cuatro madres transgénicas fueron amamantadas por madres wild type y viceversa. Los ratones transgénicos alimentados por madres transgénicas presentaron una menor prevalencia de diarrea a los 3, 4 y 7 DPI en relación alcontrol. A los 8 DPI, estos ratones habían resuelto por completo el cuadro clínico. Asimismo, redujeron la infección intestinal por RVA y la excreción viral en heces en comparación con elcontrol. Con respecto a los ensayos de cross-fostering, los resultados obtenidos fueron contradictorios. Si bien los ratones wild type amamantados por madres transgénicas redujeron laprevalencia y duración de la diarrea en relación a los ratones amamantados por madres wild typecomo se esperaba, presentaron mayores títulos infecciosos en el intestino y una mayor excreciónviral fecal. Con el propósito de comparar la eficacia de la administración oral de VHH anti-VP6 conotras opciones terapéuticas disponibles para tratar la diarrea por RVA, se realizó un último experimento en el modelo de ratón lactante infectado con 1778 DD50 de RVA murino paracomparar la eficacia de los nano anticuerpos con dos drogas sintéticas (nitazoxanida, crema debismuto) y dos hierbas aromáticas usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diarrea (Aloysa citrodora, Piper aduncum): 2KD1+3B2 (50 mg/kg) + SRO, 2KD1(50 mg/kg) + SRO, nitazoxanida (15 mg/kg), crema de Bismuto (750 mg/kg), A. citrodora (infusión, 2 g/kg); P. aduncum (infusión, 2 g/kg). En este caso, los VHH fueron disueltos en SRO dado que la adición de este excipiente aumentaba significativamente la resistencia proteolítica frente a enzimas gástricas. Aexcepción de los ratones tratados con nitazoxanida, los restantes tratamientos redujeronsignificativamente la duración y la severidad de la diarrea por RVA en relación al control no tratado. En relación a los títulos infecciosos a nivel intestinal, los ratones tratados con VHH anti-VP6, cremade Bismuto y nitazoxanida disminuyeron la severidad de la infección mientras que aquellostratados con A. citrodora y P. aduncum no mostraron mejoras. La excreción viral en heces sólo seredujo en los ratones tratados con VHH y nitazoxanida pero no se apreciaron diferencias significativas en el resto de los tratamientos. El presente trabajo de tesis muestra que la administración oral de VHH anti-VP6 constituye, no sólo un tratamiento profiláctico efectivo frente a la diarrea asociada a RVA, sino también una herramienta terapéutica eficaz y segura contra la infección por este virus, incluso luego de la aparición de los primeros síntomas. En este sentido, la terapia oral con VHH anti-VP6 representaría un mejoramiento considerable en relación a otras opciones terapéuticas disponibles actualmente. Asimismo, los VHH anti-VP6 podrían ser empleados como una estrategia complementaria a la vacunación, especialmente en poblaciones que han mostrado menor eficacia de inmunización. Entérminos generales, el uso de anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 presenta un enorme potencial para su implementación en pacientes inmunocomprometidos y en países de bajos recursos, donde la mortalidad por RVA continúa siendo elevada y las actuales vacunas muestran menor eficacia.