Estudio in vivo del mecanismo de activación de la Proteína Quinasa dependiente de cAMP - Portela, Paula (2005)
La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es la enzima mejor caracterizada de la familia de las proteínas quinasas que fosforilan residuos serina/treonina. La fosforilación de proteínas blanco es crítica para la regulación de varios procesos celulares, incluyendo metabolismo, expresión génica, crecimiento y muerte celular. Actualmente, no existe un modelo adecuado que permita explicar la variedad de respuesta que genera la vía cAMPPKA como consecuencia de la acción de drogas diferentes o diversos estímulos del medio ambiente, que actúan estimulando la vía del cAMP. Varios mecanismos controlan la activación espacio-temporal y la especificidad de la respuesta de la PKA. El objetivo general de esta tesis es contribuir a un mejor conocimiento del mecanismo de activación in vivo de la PKA. Para este propósito, hemos usado Saccharomyces cerevisiae como modelo experimental. En primer término, hemos evaluado si la determinación de la actividad PKA empleando células permeabilizadas puede ser un buen indicador de la actividad quinasa en células intactas. En segundo término hemos determinado la actividad in vivo de la PKA, y el cambio en el estado de fosforilación de la subunidad catalítica, durante el aumento de cAMP intracelular evocado por un estímulo extracelular (agregado de glucosa a células crecidas en glicerol). Finalmente, hemos caracterizado a la enzima piruvato quinasa 1 (Pyk1) como sustrato de PKA, y evaluamos sus propiedades cinéticas. De los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis, concluimos que el uso de células permeabilizadas de levaduras es el método mas apropiado para seguir la activación in vivo de la PKA. Por primera vez describimos la fosforilación reversible y dinámica de la subunidad catalítica. Se puede considerar a la fosforilación de la subunidad catalítica como un nuevo mecanismo de control, preciso y reversible, de la actividad PKA en respuesta a las condiciones del medio ambiente. Finalmente, experimentos preliminares con Pyk1 indican que la especificidad del sustrato y su capacidad de participar en el proceso de activación de la PKA depende de la naturaleza estructural de éste.