Mecanismos involucrados en la exportación de la interleuquina-1 beta (IL-1ß) en los neutrófilos humanos

• Autores: Iula, Leornardo J.
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Trevani, Analía
• Materia: NEUTRÓFILO; IL-1SS; AUTOFAGIA; LC3B; NADPH OXIDASA; NEUTROPHIL; IL-1SS; AUTOPHAGY; LC3B; NADPH OXIDASE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como una molécula precursora inactiva (proIL-1β), que tras ser procesada proteolíticamente, es secretada por mecanismos definidos de forma incompleta, que son independientes de la vía canónica de secreció celular que involucra al retículo endoplasmático y al aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, investigamos los mecanismos involucrados en la secreción de IL-1β en neutrófilos aislados de sangre periférica humana. Nuestros estudios indicaron que la inhibición de la inducción de autofagia mediante el uso de inhibidores como 3-metiladenina y Wortmanina, o el bloqueo de lujo autofágico con Bafilomicina A1 (Baf A1) o E-64d, redujeron marcadamente la secreción de IL-1β inducida por LPS o LPS+ATP luego de 5 hs de cultivo. En neutrófilos diferenciados a partir de la línea celular PLB985, la reducción de la expresión (knockdow) de ATG5 mediante ARN de interferencia inhibió la secreción de IL-1β. En respuesta a la estimulación de neutrófilos con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando con el marcador de vesículas autofágicas LC3B al ser analizadas por microscopia laser confocal a las 4 horas postestimulación (p.e.). En contraposición al impacto ejercido por la inhibición de la autofogia, su inducción por privación de nutrientes incrementó la colocalización entre IL-1β y LC3B a las 4hs. p.e., y promovió significativamente la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP a las 5 hs p.e. Dado que la secreción de IL-1β en neutrófilos requiere de la actividad de la NADPH oxidasa, nos planteamos como hipótesis que la actividad de la enzima es necesaria para evitar la acidificación de las vesículas que contienen IL-1β y de esta forma prevenir su degradación por proteasas ácidas lisosomales. En favor de esta posibilidad, el tratamiento de neutrófilos con inhibidores de la NADPH oxidasa como DPI y apocinina inhibió la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP y no modificó los niveles intracitoplasmáticos de la misma, sugiriendo que la IL-1β es degradada si la enzima es inhibida. Por otro lado, en neutrófilos estimulados por 4 hs. con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando parcialmente con gp91 (componente de la NADPH oxidasa). Sin embargo, el tratamiento con DPI de neutrófilos estimulados con LPS+ATP no afectó la colocalización de la IL-1β vesicular con Lysotracker red, aunque disminuyó la colocalización de IL-1β con LC3B. Estos hallazgos indican que la actividad de la NADPH oxidasa es requerida para la secreción de IL-1β pero este efecto parece ser independiente de la acidificación de las vesículas que contienen a la IL-1β. Nuestros resultados no descartan que la NADPH oxidasa sea necesaria en otros pasos del proceso de secreción, como ser en la inducción del proceso autofágico o en la exocitosis de las vesículas autofágicas conteniendo IL-1β. Por último, también determinamos que una porción de la IL-1β sintetizada puede ser degradada por serin proteasas neutras, cuya actividad estaría determinada por el pH vesicular el cuál podría ser modulado por la actividad VATPasa. En conjunto, los hallazgos de este trabajo sugieren que la secreción de IL-1β en neutrófilos podría involucrar un mecanismo de autofagia secretoria y que la cantidad de IL-1β secretada dependería de su resistencia a ser degradada por proteasas antes de ser conducida al medio extracelular.
Interleukin-1β IL-1β is a pro-inflammatory cytokine synthesized in the cytoplasm as an inactive precursor (proIL-1β), which after proteolytical processing is secreted by poorly-defined pathways different from the canonical ER-Golgi route of secretion. In this work we investigated the mechanisms involved in the secretion of IL-1β in human peripheral blood neutrophils. We determined that the autophagy inhibitors like 3-methyladenine and Wortmannin, and the blockers of the autophagy flux such as Bafilomycin A1 or E64d, markedly reduced IL-1β secretion induced by 5 h stimulation with LPS or LPS+ATP. In neutrophil-differentiated PLB985 cells, siRNA knockdown of ATG5 abolished IL-1β secretion. Upon 4 h of LPS+ATP stimulation, IL-1β showed a vesicular distribution co-localizing with LC3B, a marker of autophagy vesicles by confocal microscopy. Furthermore, stimulation of autophagy by cell starvation markedly increased IL-1β and LC3B colocalization at 4 h p.s. and significantly promoted IL-1β secretion induced by LPS+ATP at 5 h p.s. Given that IL-1β secretion in neutrophils requires an active NADPH oxidase(NADPHox), we tested the hypothesis if the activity of this enzyme could be required to avoid the acidification of vesicles containing IL-1β and consequently IL-1β degradation in an acidic compartment. Supporting this possibility, the treatment of neutrophils stimulated by LPS+ATP with NADPHox inhibitors like DPI or Apocynin inhibited IL-1β secretion and did not induce IL-1β intracellular accumulation, suggesting that NADPHox inhibition promoted IL-1β degradation. Moreover, we observed by confocal microscopy that IL-1β partially colocalized with gp91 (the NOX component of NADPHox) upon stimulation of neutrophils with LPS+ATP. However, the treatment with DPI did not affect the vesicular colocalization of IL- 1β with Lysotracker red, even though colocalization of IL-1β and LC3B decreased. These findings suggest that NADPHox is required for the secretion of IL-1β, but this requirement appears to be independent of the regulation of the acidification of the IL-1β-containing vesicles. Our results do not rule out that NADPHox can be necessary for other steps in the secretion process, such as in the autophagy induction or the exocytosis of the content of autophagy vesicles. Finally, we also determined that a portion of the synthesized IL-1β can be degraded by neutral serineproteases, whose activity would be determined by the vesicular pH which might be modulated by the V-ATPase activity. Taken together the findings of this work suggest that IL-1β secretion in neutrophils could involve a mechanism of secretory autophagy, and that the amount of IL-1β secreted would depend on their resistance to be degraded by proteases before being driven to the extracellular medium.
Fil: Iula, Leornardo J.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.