Rol de los polihidroxialcanoatos en la resuesta al estrés desarrollada por P. putida GPo1

• Autores: Ruiz, Jimena Alicia
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Méndez, Beatriz
• Materia: POLIHIDROXIALCANOATOS; RESISTENCIA AL ESTRES; RPOS; PPGPP; AYUNO EN CARBONO; PSUDOMONAS PUTIDA (OLEOVORANS) GPO1; POLLYHYDROXYALKANOATES; STRESS RESISTANCE; RPOS; PPGPP; CARBON STARVATION; PSEUDOMONAS PUTIDA (OLEOVORANS) GPO1
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La supervivencia de los microorganismos en la naturaleza depende de su habilidadpara adaptarse rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales. Por estemotivo, las bacterias han desarrollado estrategias de supervivencia, mecanismos decontrol activos que les permiten hacer frente a las condiciones adversas y que facilitanel reajuste de la célula a nuevas situaciones. Uno de estos mecanismos es la Respuestageneral a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante distintas condicionesde estrés ambiental, tales como escasez en nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo ycambios bruscos de temperatura. Los genes involucrados en la resistencia al estrés seencuentran bajo el control de una subunidad sigma alternativa de la RNA polimerasadenominada σˢ, codificada por el gen rpoS. El nivel intracelular de σˢ se regula a niveltranscripcional, traduccional y de estabilidad de la proteína. Otra respuesta desencadenada ante condiciones de estrés es la Respuesta Estricta,que se caracteriza por un aumento en el nivel intracelular de la alarmona (p)ppGpp. Dicha molécula modula la expresión de varios genes, entre ellos el rpoS. Tanto en E.coli como en Pseudomonas se demostró que el ppGpp tiene un efecto positivo sobre latranscripción de rpoS. Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva bacterianos cuyaacumulación y degradación favorece la supervivencia de los microorganismos en elambiente. Resultados obtenidos previamente en el laboratorio, demostraron que ladegradación del PHA acumulado incrementaba la supervivencia y la resistencia al estrésde la bacteria Pseudomonas putida en microcosmos de agua de río. Teniendo en cuenta estos aspectos, el objetivo general de la presente tesis doctoralfue estudiar el papel de los polihidroxialcanoatos en los mecanismos de repuesta alestrés en P. putida. Para esto se utilizó una cepa salvaje y una cepa con una mutación enla enzima PhaZ, encargada de degradar PHA, y se analizó el contenido intracelular deppGpp en condiciones de depolimerización de PHA, así como también la resistencia aestrés térmico y oxidativo, y el contenido intracelular de os durante ayuno en carbono. Los resultados obtenidos mostraron que existe un aumento transitorio en el nivelintracelular de ppGpp, aproximadamente 5 hs después del comienzo de la degradaciónde PHA. No se observó incremento en el contenido de ppGpp en la cepa mutanteincapaz de degradar el polímero. La complementación de la mutación phaZ restauró elfenotipo salvaje. Asimismo, se observó que la capacidad de degradación de PHAincrementaba el nivel intracelular de σˢ y la resistencia a estrés térmico y oxidativodurante ayuno en carbono. La introducción del gen que codifica para la depolimerasa de PHA en la cepa mutante phaZ incrementó el contenido de RpoS y la tolerancia al estrés. Estos resultados sugieren que existe una relación entre la depolimerización de PHA y la Respuesta general a estrés controlada por RpoS, que tal vez se encuentre mediada porppGpp.
Survival of microorganisms in nature depends on their ability to adapt to changes inenvironmental conditions. For this reason, bacteria have developed survival strategies,active control mechanisms that allow them to cope with adverse conditions andfacilitate the cell readjustment to new situations. One of these mechanisms is the General stress response induced in Gram-negative bacteria in response to severalenvironmental stresses, such as nutrient starvation, osmotic stress, oxidative stress andabrupt temperature changes. The genes involved in stress resistance are under thecontrol of an alternative sigma subunit of the RNA polymerase, σˢ, encoded by the rpoSgene. The intracellular level of σˢ is regulated at several levels, including transcription,translation and protein stability. Another mechanism triggered by stress conditions is the Stringent response. Thisresponse is characterized by an increase in the intracellular level of the alarmone (p)ppGpp. This molecule modulates the expression of several genes, including rpoS. The involvement of ppGpp as a positive signal for rpoS expression has been reported in E. coli and Pseudomonas. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are bacteria] reserve polymers that enhance survivaland competition abilities of microorganisms in the environment. Previous results of ourlaboratory, demonstrated that PHA degradation increased survival and stress resistanceof Pseudomonas putida in river water microcosms. Considering all these aspects, the general purpose of this PhD. thesis was to studythe role of PHAs in the stress response mechanisms in P. putida. For this purpose weused a P. putida wild type strain and a mutant in the PhaZ enzyme, which is involved in PHA degradation, to analyze the ppGpp intracellular levels in PHA depolymerizationconditions; as well as the resistance to thermal and oxidative stress, and the intracellularσˢ content during carbon starvation. The results showed that PHA degradation is followed by an increase in ppGppintracellular levels. This increase was not observed in the mutant strain unable todegrade the polymer. The complementation of the phaZ mutant restored the wild typephenotype. Moreover, it was observed that the capacity of PHA degradation increasedthe intracellular σˢ level and the resistance to heat shock and oxidative stress duringcarbon starvation. The introduction of the gene that codes for the PhaZ depolymerase inthe mutant strain, increased RpoS content and tolerance to stress agents. These resultssuggest a relation between PHA depolymerization and the General stress responsecontrolled by RpoS, that could be mediated by ppGpp.
Fil: Ruiz, Jimena Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.