Estudio de las proteínas CRISP como reguladores de la fertilidad y el sistema inmune - Curci, Ludmila (2019)
Las proteínas de la familia CRISP1-4 (Cysteine-RichSecretoryProteins) se expresan tanto en el tracto reproductor de mamíferos donde actúan como mediadores del proceso de fertilización, como en órganos de importancia inmunológica. En base a ello, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido investigar la relevancia de las CRISP como reguladores tanto de la fertilidad como del sistema inmune a través del empleo de animales simples y múltiples knockout (KO) para las CRISP. Teniendo en cuenta resultados previos de nuestro laboratorio indicando que la proteína CRISP1 exhibe la capacidad de inhibir a CatSper, el principal canal de calcio del espermatozoide esencial para la fertilidad masculina, como primer objetivo nos planteamos continuar investigando la actividad de CRISP1 como regulador de CatSper y explorar su posible empleo para el desarrollo de un método anticonceptivo masculino. Los resultados revelaron que la exposición de espermatozoides a HC-056456 (HC), un compuesto que inhibe la actividad de CatSper tal como CRISP1, fue capaz de inhibir la capacidad fertilizante de los espermatozoides tanto in vitro como in vivo, apoyando la posibilidad de desarrollar un método anticonceptivo masculino basado en la actividad inhibitoria de CRISP1 sobre CatSper. La normal fertilidad de los machos simples KO para las proteínas CRISP1, CRISP2 y CRISP4 generados en nuestro laboratorio, junto a la observada subfertilidad de los machos carentes de dos proteínas CRISP (CRISP1 y CRISP4) simultáneamente, apoyan la existencia de mecanismos de compensación entre los diferentes miembros de la familia CRISP. En base a ello, y considerando la no disponibilidad del ratón simple KO para la proteína CRISP3, el segundo objetivo de esta Tesis consistió en el desarrollo y caracterización tanto del animal simple KO para CRISP3 como de animales múltiples KO para diferentes CRISP a través del empleo de la técnica CRISPR/Cas9. Los resultados revelaron que la presencia de la mutación en el gen Crisp3 afectó la expresión de CRISP1, llevando a la generación de un animal doble KO (DKO) para CRISP1 y CRISP3. La caracterización de estos animales a nivel reproductivo mostró una bajada significativa de la fertilidad tanto en los machos como en las hembras, representando ésta la primera evidencia de la relevancia de las CRISP para la fertilidad femenina. Más aun, observamos que la subfertilidad de esta colonia se debería, principalmente, a defectos en el desarrollo temprano de los embriones, revelando por primera vez el rol de las CRISP en eventos posteriores a la fertilización. Los animales carentes de más de dos proteínas CRISP simultáneamente se generaron empleando una construcción capaz de interferir con los genes Crisp1 y Crisp3 en animales fértiles DKO CRISP2/CRISP4 disponibles en el laboratorio. El estudio de la fertilidad de los animales triples (TKO) y cuádruples (CKO) KO generados reveló que los machos eran prácticamente infértiles a juzgar por un promedio de crías por camada inferior a 1. El análisis de los mecanismos subyacentes a este fenotipo reveló defectos en la migración por el tracto femenino y capacidad fertilizante de los espermatozoides como así también en el desarrollo embrionario temprano, indicando que la severa bajada de la fertilidad sería la resultante de una combinación de defectos a diferentes niveles. Finalmente, en base a observaciones previas de nuestro grupo indicando la presencia de CRISP1 y CRISP3 en células dendríticas (CD), investigamos el posible rol inmunoregulador de las CRISP utilizando animales simples y DKO para estas proteínas. Los resultados mostraron que la ausencia de CRISP1 y CRISP3 modifico la expresión de citoquinas de las CD y produjo un aumento en el porcentaje de Linfocitos T regulatorios en un co-cultivo de ambas células, favoreciendo una respuesta inmune de perfil tolerogénico. Consistente con ello, la inyección de células tumorales MA-10 en los animales simple KO y DKO condujo a un mayor crecimiento tumoral in vivo comparado con los controles, apoyando el rol de las CRISP en la regulación del sistema inmune. En conjunto, consideramos que estos resultados contribuirán a una mayor comprensión de los mecanismos involucrados en la regulación de la fertilidad y del sistema inmune, abriendo la posibilidad de que las CRISP sean empleadas en el futuro como agentes diagnósticos y/o targets terapéuticos.