Mecanismos involucrados en la resistencia celular a la acción de eritropoyetina - Schiappacasse, Agustina (2020)
La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que más contribuye al deterioro de la calidad de vida de los pacientes con insuficiencia renal, es principalmente atribuida a la disminución del aporte de Epo debido a la reducción de la masa funcional del riñón. La purificación y clonación de esta citoquina permitió la generación de eritropoyetina recombinante (rHuEpo) usándose, en un principio, para contrarrestar la anemia de la enfermedad renal crónica, dado que el tratamiento permitía disminuir la frecuencia de transfusiones, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Luego se expandió el uso de la rHuEpo al tratamiento de la anemia asociada a distintas patologías crónicas. A partir del hallazgo de la expresión del receptor de Epo (EpoR) en tejidos no hematopoyéticos y la habilidad protectora de rHuEpo frente a respuestas inflamatorias o estímulos apoptóticos se amplió la posibilidad de su espectro terapéutico. Sin embargo, esta acción no eritropoyética necesita dosis más elevadas que las utilizadas para el tratamiento de la anemia. Diversos ensayos han vinculado el uso de altas dosis de Epo con distintos efectos negativos, como estados protrombóticos o problemas cardíacos. A pesar del éxito del uso de la rHuEpo y sus derivados en diversas patologías, un porcentaje de pacientes no responde al tratamiento. Las dosis de la hormona requeridas para un tratamiento efectivo, así como la sensibilidad de los pacientes a la droga, varían ampliamente. No sólo se han descripto efectos negativos debido a las dosis elevadas, sino también resistencia al tratamiento con la hormona en pacientes que reciben dosis elevadas de rHuEpo pero no pueden alcanzar los niveles adecuados de hemoglobinemia. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento acerca de mecanismos que pueden estar involucrados en la inhibición de los efectos biológicos de Epo. Durante el desarrollo del plan de trabajo se utilizaron líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide en ensayos realizados para investigar el efecto de altas concentraciones de Epo sobre la funcionalidad de la citoquina. Por otro lado, se evaluó la acción de Epo en condiciones inflamatorias o en presencia de posibles “toxinas” que suelen acumularse en la insuficiencia renal crónica y/o en enfermedad cardiovascular. Resultados previos del laboratorio mostraron que la Epo protege a células K562 diferenciadas al linaje eritroide de la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF- α. En este trabajo se observó que este efecto protector de Epo desaparece al aumentar su concentración. La falta de cambios en la expresión del EpoR nos llevó a estudiar mecanismos involucrados con el cierre de la señal. Se sabe que la unión de Epo a su receptor ocasiona la internalización del mismo, la cual es mediada por el proteasoma. El uso del inhibidor de proteasoma MG132, permitió recuperar la actividad antiapoptótica de la Epo, sugiriendo que el uso de altas concentraciones de Epo afectaría la internalización del EpoR, llevando a la pérdida de función observada. En los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal se detecta un aumento del aminoácido no esencial homocisteína (Hcy) en sangre (hiperhomocisteinemia, HHcy). Además, se ha reportado que la HHcy puede originar un aumento intracelular de la concentración de S-adenosilhomocisteína (SAH), potente inhibidor competitivo de la mayoría de las enzimas metiltransferasas. En estadios crónicos, esta patología se asocia también a procesos inflamatorios. La acumulación de Hcy y adenosina (Ado) produce un desfasaje del ciclo de la metionina que lleva a la hipometilación de ADN. La importancia biológica de los niveles aumentados de SAH se registra principalmente en su rol en la regulación génica y en la transducción de señales. Para evaluar el efecto debido a la presencia de los dos compuestos y su relación con la función de Epo, células K562, en distintos estadios de diferenciación eritroide, fueron incubadas con Hcy y Ado, agregando a los cultivos TNF- α para simular condiciones inflamatorias. La presencia de Hcy-Ado aumentó la apoptosis celular, incrementando la actividad de caspasa 3, e indujo resistencia a la acción antiapoptótica de Epo frente al TNF- α. Se demostró que la despolarización de la membrana mitocondrial, provocada por la presencia de Hcy-Ado-TNF-α, está involucrada en el mecanismo de resistencia observada en estos tratamientos. La homocisteína tiolactona (HTL) es un derivado reactivo de la Hcy y puede unirse de forma covalente a los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en una reacción llamada N-homocisteinilación. Aquí, se demostró que la Epo puede ser N-homocisteinilada (HTLEpo). Se observó disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis de las células UT-7, dependientes de Epo, al ser tratadas con la hormona previamente incubada con HTL. Mediante diversos estudios estructurales se demostró que la molécula de Epo sufre modificaciones por N-homocisteinilación. La Epo N-homocisteinilada muestra un aumento en las estructuras de hoja- β en detrimento de α-hélice. Este aumento de hojas- β repetitivas se relaciona con la formación de oligómeros, con menor movilidad electroforética. El aumento del radio de la proteína N-homocistenilada, determinado por la técnica de dispersión de luz dinámica, apoya la hipótesis de la formación de oligómeros solubles. Estos cambios estructurales en la molécula perturbarían la adaptación espacial requerida para una interacción ligando-receptor eficiente y, por lo tanto, se produciría la alteración de las funciones proliferativa y antiapoptóticas de Epo. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral intentan ampliar los conocimientos referentes a posibles mecanismos involucrados en la resistencia al tratamiento con Epo en varias patologías. En modelos celulares, observamos en presencia de altas concentraciones de Epo, una alteración de su funcionalidad, relacionada con un aumento de la velocidad de silenciamiento del receptor, vinculamos un posible efecto entre el aumento de la concentración de Hcy y Ado con la resistencia a la activación celular por Epo y describimos por primera vez la modificación estructural ocasionada por N-homocisteinilación de la Epo que conduce a alteraciones funcionales.