Estudio de la expresión y modulación de los reguladores del ciclo celular y microARNs en la auto-renovación y diferenciación neuronal de celular madre pluripotentes humanas

• Autores: Rodríguez Varela, María Soledad
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Romorini, Leonardo
• Materia: CICLINA E1; CICLO CELULAR; FACTORES DE TRANSCRIPCION E2F; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES HUMANAS; PROGENITORES NEURALES; DIFERENCIACION NEURONAL; microARNs; miR-302; miR-145; miR-296; CLUSTER miR-216/217; CYCLIN E1; CELL CYCLE; E2F TRANSCRIPTION FACTORS; STEM CELLS; HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS; NEURAL PROGENITORS; NEURONAL DIFFERENTIATION; microRNAs; miR-302; miR-145; miR-296; miR-216/217
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre pluripotentes humanas (CMPhs) consisten en las células madre embrionarias humanas (CMEhs) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (CMPihs). Las mismas ofrecen oportunidades extraordinarias para varios aspectos de la salud humana dadas su capacidad de auto-renovación (habilidad de dividirse casi ilimitadamente sin perder sus propiedades) y pluripotencia (habilidad de diferenciarse y dar origen a todos los tipos celulares de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo). El programa genético que controla el mantenimiento de las propiedades de las CMPhs está estrictamente ligado a la regulación del ciclo celular. Si bien estas células exhiben las cuatro fases canónicas del ciclo celular (G1, S, G2 y M), presentan una regulación muy peculiar del mismo, con un tiempo de duplicación corto debido a una fase G1 abreviada. Entre los reguladores maestros del ciclo celular encontramos a las ciclinas y los factores de transcripción E2F (E2Fs), involucrados en la progresión del ciclo celular. Los microARNs (miRNAs) son moléculas de ARN no codificantes de aproximadamente 18-24 nucleótidos que regulan la expresión génica a un nivel post-transcripcional. Numerosos estudios han demostrado que los miRNAs desempeñan roles críticos en el mantenimiento de la auto-renovación y la diferenciación de las CMPhs, para lo que la regulación del ciclo celular resulta esencial. Una gran fracción de los miRNAs conocidos se expresa en el cerebro humano y, por lo tanto, están emergiendo como fuertes mediadores del desarrollo neuronal, desde la inducción neuronal de progenitores neurales hasta la expansión, diferenciación y especificación de subtipos neuronales. Es sabido que la duración de la fase G1 contribuye a la determinación del destino celular de las CMPhs, dado que en este momento las células son receptivas a las señales de diferenciación. En este proceso, las ciclinas y los factores de transcripción E2F son esenciales. Además, numerosos miRNAs presentan transcriptos blanco que, directa o indirectamente, coordinan el ciclo celular y diferenciación de las CMPhs. En este sentido, el objetivo de esta tesis consistió en analizar tanto la expresión y regulación de los complejos que operan en la fase G1 del ciclo celular a lo largo de la diferenciación de las CMPhs a neuroprogenitores; como también dilucidar la participación de los miRNAs tanto en la regulación del ciclo celular, en particular aquellos regulados por los factores de transcripción E2F, como en el proceso de diferenciación celular a neuronas. Previamente determinamos el perfil de expresión temporal de las principales ciclinas y E2F en CMEhs H9 y en progenitores neurales derivados a partir de las mismas. En el presente trabajo, pudimos profundizar dicho estudio centrándonos en el análisis de la expresión de la CICLINA E1. Mediante la sincronización de cultivos celulares, determinamos que los niveles de expresión del ARNm y proteína de la CICLINA El aumentan en la fase G1 tardía tanto en las CMPhs como en los progenitores neurales. Además, demostramos que los niveles de expresión del ARNm de la CICLINA E1 en CMPhs se hallan regulados por la activación de la vía de MEK/ERK y los factores de transcripción c-MYC y E2F. Asimismo, observamos una marcada disminución (degradación) de los niveles proteicos de la CICLINA E1 en G2/M y determinamos que la misma está mediada por el proteosoma por un mecanismo que requiere de una CDK2 funcional pero no de la actividad de GSK3β. Con estos cultivos sincrónicos también pudimos demostrar cómo son expresados temporalmente los miR-145, miR-296 y la familia del miR-302 a lo largo del ciclo celular de las CMPhs. Los miR-145 y miR-296 son miRNAs que se inducen durante la diferenciación y silencian el programa de auto-renovación y pluripotencia. La familia del miR-302 es esencial para la pluripotencia de las CMPhs y su expresión disminuye durante la diferenciación. En particular, determinamos que la expresión de la familia miR-302 se induce en la transición G1/S y alcanza su punto máximo en las fases S-tardía y G2/M-temprana, posiblemente para impedir el comienzo de la diferenciación. Además, por medio de un análisis de ontología génica confirmamos que muchos de los genes blanco de la familia del miR-302 están involucrados en la regulación del ciclo celular. A su vez, derivamos y caracterizamos progenitores neurales a partir de las CMPhs y neuronas diferenciadas a partir de estos progenitores neurales. Luego, por medio de una secuenciación masiva de pequeños ARNs determinamos el miRNoma de estas poblaciones celulares como así también el que caracteriza a CMPhs tratadas con un inhibidor general de los E2Fs (inhibidor pan-E2F) en comparación con CMPhs control. En ambas caracterizaciones estudiamos los miRNAs expresados diferencialmente y luego validamos algunos candidatos. Por un lado, pudimos concluir que los niveles de expresión de los miR-19a-3p, miR 19b-3p, miR-4454, miR-1260a, miR-1260b, miR-454-3p y miR-301a-3p estarían regulados por los E2Fs canónicos. Por el otro, al analizar los miRNAs expresados diferencialmente durante la diferenciación neuronal, centramos nuestra atención en el clúster de los miR-216/217, el cual se expresa exclusivamente en lo progenitores neurales y neuronas, y su expresión no es detectable en las CMPhs. Además, al analizar datos bioinformáticos publicados de diferenciaciones a mesodermo y endodermo, no encontramos una inducción en los niveles de expresión de los miRNAs de este clúster en éstas diferenciaciones específicas de linaje. Asimismo, modulamos la expresión del miR-217-5p (uno de los miembros del cluster) mediante ensayos con moléculas exógenas (mimic/inhibitors). Encontramos que la sobre-expresión del miR-217-5p en CMPhs aumentó el porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular. En contraste, no observamos diferencias en el perfil del ciclo celular en los progenitores neurales tratados tanto con las moléculas exógenas que inhiben como con las que sobre-expresan al miR-217-5p. Además, encontramos por un lado una disminución significativa en la expresión del transcripto del marcador de pluripotencia OCT-4 y del gen blanco candidato del miR-217-5p: GRIA3; y por el otro una disminución significativa en los genes blanco candidatos del miR-217-5p: WEE1, SIRT1 y CICLINA D1 en las CMEhs y CMPihs respectivamente, que sobre-expresan este miRNA en relación al control en cada línea celular. Consideramos que sería interesante profundizar este estudio, en especial determinar si esta modulación en la expresión de los transcriptos ocurre a nivel proteico, y si la misma se asocia al cambio en el perfil del ciclo celular que observamos en las CMPhs que sobre-expresan el miR-217-5p. Creemos que los resultados de este trabajo pueden contribuir al entendimiento de los procesos moleculares que regulan tanto al ciclo celular como la diferenciación neuronal de CMPhs. Además, el identificar la relevancia biológica de los factores reguladores del ciclo celular de las CMPhs, como así también de cierto microARNs involucrados en la diferenciación neuronal de éstas células permitirá diseñar estrategias para obtener una población celular dotada de una alta capacidad proliferativa inicial y de un total compromiso hacia el linaje específico, plausibles de emplear en un futuro en terapias de reemplazo.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) consist of human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (hiPSCs). These cells offer extraordinary opportunities for several aspects of human health given its capacity of self-renewal (ability to divide almost unlimitedly without losing their properties) and pluripotency (ability to differentiate and give rise to all types of cells derived from the three germ layers; endoderm, mesoderm and ectoderm). The genetic program that controls the maintenance of the hPSCs properties is strictly linked to the cell cycle regulation. Although these cells exhibit the four-cell cycle canonic phases (G1, S, G2 and M), they have a peculiar regulation, such as a short doubling time due to an abbreviated G1 phase. Between the cell cycle master regulators, we can find cyclins and the E2F transcription factors (E2Fs). MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs molecules of 18-24 nucleotides that regulate gene expression at a post-transcriptional level. Several studies have shown that miRNAs play key roles in hPSCs self-renewal and pluripotency for what cell cycle regulation is essential. A large fraction of the known miRNAs are expressed in the human brain and are therefore emerging as strong mediators throughout neural development from neural induction to neural progenitor's expansion, differentiation and neuronal subtype specification. It is known that G1 phase duration contributes to hPSCs fate determination, as in this moment cells are receptive to differentiation cues. In this process, cyclins and E2F transcription factors are essential. Besides, numerous miRNAs target transcripts that directly or indirectly coordinate hPSCs cell cycle and differentiation. In this sense, the objective of this thesis consisted in analyzing both the expression and regulation of the complexes that operate in the G1 phase of the cell cycle throughout the differentiation of hPSCs to neuroprogenitors; as well as elucidating the participation of miRNAs both in the regulation of the cell cycle, in particular those regulated by the E2F transcription factors, and in the process of cell differentiation into neurons. Previously, we demonstrated the temporal expression pattern of the major cyclins and E2Fs in H9 hESCs and neural progenitors derived from these cells. In the present work we deepen this study focusing on CYCLIN E1 analysis. By generating synchronized cultures, we determined that CYCLIN E1 mRNA and protein expression levels increased in late G1 phase in both hPSCs and neural progenitors. Additionally, we demonstrated that CYCLIN E1 mRNA expression levels involve the activation of MEK/ERK pathway and the transcription factors c-MYC and E2Fs in hPSCs. In addition, we observed a marked down-regulation (degradation) of CYCLIN E1 protein in G2/M and determined that it is mediated by the proteasome by a mechanism that requires a functional CDK2 but not GSK3ẞ activity. Furthermore, with these synchronized cultures, we could demonstrate how miR-145, miR-296 and miR 302 family are temporally expressed along hPSCs cell cycle. miR-145 and miR-296 are miRNAs that are induced during differentiation and silence the self-renewal and pluripotency program. miR-302 family is essential for hPSCs stemness and its expression decreases during differentiation. Particularly, we determined that miR-302 family expression is induced at G1/S transitions and peaked at late S-early G2/M phases, presumably to impede differentiation onset. Besides, we confirmed by a gene ontology analysis that many validated miR-302 family target genes are involved in cell cycle regulation. Also, we derived and characterize neural progenitors from hPSCs, and differentiated neurons from these neural progenitors. Next, through massive sequencing of small RNAs we determined the miRNoma of these cell population as well as the one that characterize hPSCs treated with a E2Fs general inhibitor (pan-E2F inhibitor) in comparison with control hPSCs. In both characterizations, we studied the differentially expressed miRNAs and then validated some candidates. On the one hand, we could conclude that canonical E2Fs would regulate miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-4454, miR-1260a, miR-1260b, miR-454-3p and miR-301a-3p expression levels. On the other, when we analyze the miRNAs differentially expressed during neuronal differentiation, we focused our attention to the miR-216/217 cluster, which was highly expressed in neural progenitors and neurons, without measurable expression levels in hPSCs. Furthermore, when we analyzed published bioinformatics data of mesoderm and endoderm differentiations, we did not find an induction in the expression levels of this miRNA cluster among these lineage specific differentiations. In addition, we modulate the expression levels of miR-217-5p (one of the cluster members) in hPSCs and neural progenitors using exogenous molecules (mimic/inhibitors). We found that over-expression of miR-217-5p in hPSCs increased the percentage of cells residing in the G1 phase of the cell cycle. In contrast, we did not observe differences in the cell cycle profile in neural progenitors treated with either the exogenous molecules that inhibit or overexpress miR-217-5p. In addition, we found, on one hand, a significant decrease in the expression of the pluripotent marker transcript OCT-4 and the miR-217-5p candidate target gene GRIA3; and on the other, a significant decrease in the miR-217 candidate target genes: WEE1, SIRT1 and CYCLIN D1 in hESCs and hiPSCs treated with the miR-217-5p mimic, respectively, versus each cell line control. We consider that it would be interesting to deepen this study, especially to determine if this modulation in the mentioned transcripts expression occurs at the protein level, and if its associated to the observed change in the cell cycle profile in the hPSCs that overexpress the miR-217-5p. We believe that the results of this work can contribute to the knowledge of the molecular processes that regulate both the cell cycle and neuronal differentiation of hPSCs. In addition, identifying the hPSCs cell cycle regulators biological relevance, as well as certain miRNAs involved in the neuronal differentiation of these cells, will allow to design strategies to obtain a cell population endowed with a high initial proliferative capacity and a total commitment towards the specific lineage, plausible to use in the future in replacement therapies.
Fil: Rodríguez Varela, María Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.