Células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer : desarrollo de una vacuna anti-melanoma en un modelo experimental - Goldszmid, Silvana Romina (2003)
La incidencia del melanoma aumenta a mayor velocidad que la de otros cánceres y lasobrevida de pacientes con metástasis distantes es generalmente < l año. Con el avance en lacomprensión de los requerimientos para inducir inmunidad las CD se han convertido enatractivos vectores para la inmunoterapia del cáncer. Consideradas las más potentes célulaspresentadoras de Ag (APC), las células dendríticas (CD) actúan como centinelas del sistemainmune, patrullando a través de la sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoidessecundarios alertando al sistema inmune y controlando sus decisiones más tempranas. En laperiferia las CD inmaduras capturan antígenos (Ag) y migran hacia los órganos linfoidessecundarios donde presentan dichos Ag a linfocitos T naïve induciendo la activación de larespuesta inmune. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue estudiar desarrollar una vacuna anti-melanomautilizando CD cargadas con células tumorales apoptóticas y estudiar los mecanismosinvolucrados en la respuesta inducida contra el tumor. Para ello, se utilizó el modelo demelanoma murino B16. El melanoma B16 es un tumor de origen espontáneo, débilmenteinmunogénico y por lo tanto provee un marco adecuado para el estudio de la modulación de larespuesta inmune anti-tumoral. Las CD aisladas a partir de precursores de médula ósea fueron cultivadas en presencia desobrenadante de cultivo de la línea productora de GM-CSF establecida mostraron un fenotipoinmaduro con baja expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y alta capacidad decaptación antigénica tanto por fagocitosis de Ag particulados como endocitosis demacromoléculas. Luego de inducir la maduración con LPS se observó un marcado aumento en laexpresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y un aumento en la capacidadestimulatoria en cultivos mixtos alogeneicos. Ensayos de migración in vitro mostraron la altacapacidad migratoria de las CD inmaduras en respuesta a estímulos inflamatorios y de CDmaduras en respuesta a quimioquinas constitutivamente secretadas en los ganglios linfáticos. Secomprobó también, mediante la realización de ensayos de migración in vivo, que las CDinyectadas subcutáneamente eran capaces de migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje. Estos resultados reflejaron el potencial de las CD obtenidas para su utilización en el diseño deuna vacuna anti-tumoral. La apoptosis de las células B16 fue inducida por radiación y y evidenciada por tinción con Anexina V / IP. 48 hs después de la irradiación se observaron 70 —80 % de células apoptóticascaracterizadas por la tinción Anexina +/ IP - comparadas con lO—12 % en las células sin tratar. Las células Bl6 apoptóticas fueron eficientemente fagocitadas por CD inmaduras. Luego de 24hs de cocultivo gran proporción (> 50 %) de CD había incorporado material apoptótico según seevidenció por FACS, microscopía confocal y microscopía electrónica. El cocultivo con células tumorales apoptóticas indujo la maduración de las CD, evidenciada porun aumento en la expresión de MHC II y CD86 respecto a CD inmaduras cultivadas en ausenciade células apoptóticas. Dicho aumento se observo principalmente en la población de CD quehabía incorporado material apoptótico. Otra evidencia de la maduración de las CD, fue lamarcada disminución de la capacidad endocítica con respecto a CD inmaduras (intensidad defluorescencia media 35,8 vs. 192,5). Luego de ser inyectadas subcutáneamente, CD cocultivadascon células apoptóticas o CD solas migraron hacia los ganglios linfáticos en forma comparable. Las CD encontradas en los ganglios correspondían a ~0.5% del inoculo original y en ambos casosse observo una expresión uniforme de MHC II y CD86 equivalente a la observada en CDmaduras. La vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) indujo un alto nivelde protección contra el desarrollo del melanoma B16: 80 % de los animales permanecieron libresde tumor 12 semanas después del desafió. Dicha protección fue especifica para el melanoma B16,ya que todos los animales vacunados desarrollaron tumor cuando fueron desafiados con un tumorsingeneico no relacionado. 80 % de los animales vacunados con CD-Apo y desafiados 10 semanas después de lainmunización permanecieron libres de tumor, consistente con la inducción de memoriainmunológica. Estudios de depleción in vivo de subpoblaciones linfocitarias demostraron que tantolinfocitos T CD4+ como CD8+ son son necesarios para la efectiva vacunación con CD-Apo. Seevidenció que ambas poblaciones linfocitarias son activadas para la producción de IFNy cuandoson estimuladas con CD-Apo y CD-TRP-2. Además, los linfocitos CD8+ son capaces dereconocer células Bl6 intactas in vitro y de lisar células pulsadas con TRP-2 in vivo. El estudio de la inmunidad humoral demostró la presencia de anticuerpos específicosdirigidos contra las ce'lulas B16. Por último, en el análisis del sitio de inyección del tumor seobservó un importante infiltrado de neutrófilos a tiempos muy tempranos, siendo máximo seisdías después de la inyección del tumor. La presencia de linfocitos en el sitio de inyección seobservó más tardíamente. Esto podría indicar que los neutrófilos también juegan un rolimportante en el rechazo tumoral. En el presente trabajo de Tesis se ha demostrado por primera vez, que la vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) induce inmunidad a largo plazodependiente de la acción combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra el melanoma B16débilmente inmunogénico. Este modelo preclínico provee el marco necesario para la realizaciónde estudios clínicos comparables utilizando CD-Apo como adyuvante para la inmunización activacontra el cáncer.