Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con Lewisx : estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo - Capurro, Mariana Isabel (1999)
Este trabajo de Tesis se ha basado en la producción de anticuerpos monoclonales (AMC) dirigidos contra las células troncales de carcinoma mamario humano. lacaracterización e identificación de los antígenos (Ag) reconocidos por los mismos y laevaluación de la posible utilidad diagnóstica y terapéutica de dichos AMCs. Para suobtención, se inmunizaron ratones Balb/c con células provenientes de un paciente conun carcinoma de mama agresivo y altamente indiferenciado, negativo para laexpresión de ER y PgR, estrategia seguida con la idea de minimizar la producción de AMCs dirigidos contra Ags asociados a la diferenciación celular. De los hibridomas obtenidos fue seleccionado el AMC FC-2.15, de isotipo IgM, el cualreacciona con la mayoría de los carcinomas mamarios humanos, independientementede su tipo histológico y grado de diferenciación, reconociendo en los mismos al 80 %de las células tumorales y al 90 % de las células proliferantes del tumor, entre las quese encuentran las células troncales. El AMC FC-2.15 reconoce otras neoplasias, comocarcinoma de colon y leucemia mieloide crónica y presenta escasa reactividad con lamayoria de los tejidos normales, siendo la principal reacción cruzada con losleucocitos polimorfonucleares (PMN). En cuanto al Ag FC-2.15, la caracterización bioquímica inicial indicó un Ag denaturaleza glicoproteica, residiendo el epitope en la parte hidrocarbonada del mismo. Posteriores experimentos demostraron que el AMC FC-2.15 reconoce específicamenteal trisacárido Lewis˟ o CD15, terminalmente expuesto. Esta conclusión está basadatanto en el reconocimiento específico del AMC FC-2.15 por diferentes estructurasconteniendo Lewis˟ como en la inhibición observada en un ELISA realizado utilizandoun AMC comercial anti-CD15 como inhibidor. Asimismo, se determinó que el AMC FC-2.15no presenta reacción cruzada con el tetrasacárido sialil Lewis˟, ni con su isómero Lewisª, así como tampoco con antígenos de grupo sanguíneo A o B La reactividad del AMC FC-2.15 en los diferentes tejidos FC-2.15 -positivos fueanalizada por Western Blot sobre extractos de membrana y caracterizadadeterminando el efecto de digestiones enzimáticas (con PNGasaF y Neuraminidasa)en la persistencia del Ag. Los resultados obtenidos revelaron que Lewis˟ puede estarformando parte tanto de N-glicoproteínas como de O-mucinas. Según el tipo celularestudiado, Lewis˟ está presente en N-glicoproteínas exclusivamente (bandas de 250, 185 y 105 kDa en muestras de PMN y leucemia), predominantemente en N-glicoproteínas (bandas de 155 y 135 kDa, acompañadas con mucinas de mayor pesomolecular, en células de carcinoma de colon T-84) o predominantemente en O-mucinas (células de carcinoma de mama MCF-7).También puede variar la cantidad delactosaminoglicanos portando sialil Lewis˟, desde la ausencia (MCF-7), pasando poruna baja proporción respecto de los Lewis˟-lactosaminoglicanos (PMN) hasta llegar aun gran predominio de los mismos en leucemias y T-84. Puede concluirse, por lo tanto, que PMN normales y diferentes células tumoralespueden expresar residuos Lewis˟ y sialil Lewis˟ en muy diferente proporción y unidos adiferentes proteínas, aunque la relevancia de Lewis˟ en condiciones normales ypatológicas tiene que ser aún establecida. En cuanto a las propiedades funcionales del AMC FC-2.15, numerosos experimentosse han realizado en esta Tesis tendientes a caracterizar la interacción del AMC FC-2.15con PMN y con MCF-7, tanto in vitro como en un sistema ex vivo de circulaciónsanguínea (SEVCS). Ensayos de aglutinación han demostrado que el AMC FC-2.15 induce la agregaciónhomotípica de PMN in vitro y forma agregados heterotípicos entre PMN y célulastumorales Lewis˟-positivas. Ensayos de liberación de [51Cr]han revelado que el AMC FC-2.15 ejerce un fuerte efecto citotóxico sobre los PMN y células MCF-7 por fijaciónde complemento humano. Posteriormente, con la idea de aproximar a las condicionesen las que el AMC FC-2.15 interacciona in vivo, el ensayo de liberación de [51Cr]fuerealizado en sangre entera en circulación en un SEVCS. Contrariamente a loesperado, el AMC FC-2.15 aglutina, pero no lisa, a los PMN mientras que la lisis de MCF-7 en dicho sistema es prácticamente normal. Estas observaciones permitieron plantear la posibilidad de que en el SEVCS los PMNserían inducidos a agregarse mas rápidamente por la suma de dos mecanismosdistintos: el AMC FC-2.15 que activa a los PMN y el flujo aplicado. En la medida quelos agregados van siendo formados, habría un impedimento estérico progresivo parael acceso de los factores del sistema de complemento a la porción Fc del AMC FC-2.15y por ende los grumos de PMN formados no serían lisados. Los experimentos realizados posteriormente validaron esta hipótesis puesto quedemostraron que el AMC FC-2.15 no lisa agregados homotípicos de PMN preformadosen ensayos in vitro por un lado y que el AMC FC-2.15 es capaz de lisar a los PMN enel SEVCS, cuando la aglutinación de los mismos se impide por pretratamiento concolchicina, por otro. La lisis de MCF-7 en el SEVCS tendría lugar de todas formas debido a su incompletaagregación con los PMN. Puede concluirse entonces que la falta de lisis de los PMN por el AMC FC-2.15 encirculación y, que por el contrario, las células tumorales Lewis˟-positivas seaneficientemente lisadas, son dos caracteristicas importantes que avalan el uso del AMC FC-2.15 en el tratamiento de tumores Lewis˟-positivos, sin riesgo de producir una lisismasiva de los PMN circulantes. Los resultados presentados indican que el AMC FC-2.15 podría ser útil en lainmunoterapia pasiva de pacientes con carcinomas Lewis˟-positivos, sin necesidad deconjugarlo con drogas ni toxinas.