Estudio de las vías de señalización e inflamatorias del canal P2X7 y su variante polimórfica Gln460Arg en células del sistema nervioso central

• Autores: Aprile García, Fernando
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Arzt, Eduardo Simón; Liberman, Ana Clara
• Materia: P2X7; CALCIO; ERK1/2; PARP1; MICROARRAY; DEPRESION; P2X7; CALCIUM; ERK1/2; PARP1; MICROARRAY; DEPRESSION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los receptores P2X7 son canales de calcio activados por ATP conformados porsubunidades de dos pasos de membrana que se asocian como homotrímeros. Sus efectos sonmediados por activación de la vía de las MAPK que incluye a BRaf y ERK 1/2. En el sistemanervioso central, regulan la liberación de neurotransmisores y citoquinas, y la activación glialfrente a situaciones inflamatorias. Mediante distintos estudios genéticos se encontró quepacientes con trastornos depresivos poseen, con una incidencia significativa, una variantepolimórfica del gen P2X7, que consiste en un cambio de un único nucleótido que produce lasustitución de Glutamina por Arginina en la posición 460 (Gln460Arg). El objetivo principal de esta tesis consiste en investigar la relación funcional entre estavariante polimórfica del receptor y la aparición de trastornos psiquiátricos. En particular, seestudiaron las cascadas de señalización activadas por el receptor P2X7, poniendo énfasis en elingreso de calcio extracelular tras dicha activación, el rol de la cascada de las MAPK y losefectos funcionales y transcripcionales que derivan de dicha activación. Primeramente, se observó que en homocigosis la variante mutada de P2X7 tiene lamisma funcionalidad que el receptor wild-type (WT). En cambio, cuando ambas subunidadesfueron coexpresadas se produjo una marcada disminución en la entrada de calcio y en laactivación de la MAPK ERK 1/2. Se demostró además que ambas subunidades interactúanfísicamente en la membrana celular de células coexpresoras, asociándose para formar trímerosfuncionales de P2X7 compuestos por subunidades WT y Gln460Arg. A su vez, nuestro grupocolaborador en el Max-Planck en Munich, Alemania, demostró que solamente los ratonesknock-in que expresan ambas variantes del receptor P2X7 humano, y no aquellos queexpresan una única variante, muestran alteraciones del comportamiento similares a aquellasque presentan pacientes con depresión. A continuación, se buscaron proteínas involucradas en la transducción de señales de P2X7 de interés en el marco de mecanismos inflamatorios o con un posible rol en depresión. Se detectó asociada a BRaf a la proteína Poli ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), enzimaclave en la respuesta celular a procesos inflamatorios. Se demostró que P2X7 activa a PARP1,aumentando los niveles totales de poli ADP-ribosilación. Estos resultados identifican a PARP1 como un modulador clave de la transducción de señales de P2X7, y describen porprimera vez a P2X7 como activador de PARP1. Además se realizó un microarray de expresión génica con el fin de caracterizar lasconsecuencias de la coexpresión de ambas variantes a nivel transcripcional. Con estos datosse realizó un análisis bioinformático global de los perfiles de expresión génica, con el cual sehallaron alteradas distintas vías de señalización relacionadas con inflamación y depresión. También identificamos genes candidatos con expresión alterada que resultan de máximointerés en el mismo contexto: CHUK (o IKKα, quinasa del inhibidor de NFκB α) y RCAN1 (regulador de calcineurina 1). Esta expresión diferencial detectada en el microarray fueposteriormente confirmada en distintos modelos, validando y profundizando dichos hallazgos. En conclusión, mediante la caracterización de las vías de transducción de señalesasociadas a la activación de las distintas variantes de P2X7, el análisis de su impactotranscripcional y su asociación con nuevas moléculas se describen por primera vez losmecanismos moleculares y celulares que podrían proveer una explicación a la asociaciónentre la presencia de la variante mutada de P2X7 y la aparición de trastornos psiquiátricoscomo la depresión.
P2X7 receptors are ATP-gated calcium channels conformed by subunits with twotransmembrane domains that assemble as homotrimers. Its effects are mediated by activationof the MAPK pathway that involves BRaf and ERK 1/2. In the central nervous system, theyregulate neurotransmitter and cytokine release, as well as glial activation after inflammatoryinjury. Different genetic approaches have demonstrated that a significant amount ofpsychiatric patients suffering from major depression possess a polymorphic variant of the P2X7 gene, consisting in a single nucleotide change leading to a Glutamine for Argininesubtitution at the position 460 (Gln460Arg). The main aim of this thesis is to investigate the functional interplay between thispolymorphic variant and the onset of psychiatric symptoms. More specifically, signalingpathways elicited by P2X7 receptor were studied, with special emphasis in calcium uptake, MAPK role and the functional and transcriptional effects derived from their activation. First of all, we report that the P2X7 polymorphic variant show the same functionalitythan its wild-type (WT) counterpart when expressed in homocygosis. In contrast, calciumuptake and MAPK ERK 1/2 activation were severely diminished when both subunits werecoexpressed. We also show that both subunits physically interact in coexpressing cells,therefore assembling P2X7 receptors that bear WT and Gln460Arg subunits. At the sametime, our partner research group at the Max-Planck Institute in Munich, Germany, showedthat only knock-in mice for both variants of the human P2X7 receptor show behavioralterations reminiscent of those observed in psychiatric patients, while homozygous knock-inmice do not. Afterwards, we looked for novel proteins involved in P2X7 signaling pathways thatwould be of interest in the context of inflammation and depression. We detected Poly ADPribosepolymerase (PARP1), a key enzime for cellular response to inflammatory processes. P2X7 activates PARP1, enhancing cellular levels of ADP-ribose. These results identify PARP1 as a key modulator of P2X7 signaling mechanisms, and describe P2X7 as a novelactivator of PARP1. Also, we performed an expression microarray with the aim of depicting thetranscriptional consequences of coexpressing both variants. This data was used to carry out aglobal bioinformatic analysis of gene expression profile. We found that different signalingpathways related to inflammation and depression were altered. We also found candidate geneswith altered gene expression that are of interest in this context: CHUK and RCAN1. Theirdifferential expression detected on the microarray was confirmed employing different models,therefore validating and gaining insight into these findings. Summing up, by means of characterizing the signaling pathways associated to theactivation of the different P2X7 variants, the analysis of their transcriptional impact and theassociation with novel molecules we describe for the first time the molecular and cellularmechanisms that could provide an explanation for the association between the P2X7polymorphic variant and the appearance of psychiatric illnesses such as depression.
Fil: Aprile García, Fernando. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.