Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función - Buschiazzo, Alejandro (1999)
La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugado a sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimáticamente y su gen clonado. Así se demostró en primer lugar, que era una actividad novedosa como transglicosidasa, ya que no utiliza como sustrato un dador nucleótido-azúcar, que en todas las otras sialiltransferasas cucarióticas conocidas, es el CMP-siálico. En segundo lugar, el análisis desecuencia reveló una lejana pero evidente homología con varias sialidasas bacterianas, y no con las sialil transferasas eucariotas. En los últimos años han surgido distintos tipos de evidencias experimentales, que involucran a la trans-sialidasa en los mecanismos de adhesión/invasión de T.cruzi a las células del mamífero huésped, en el escape temprano de parásitos invasivos de la vacuolaparasitófora de la célula hospedadora y en la evasión del camino alternativo de fijación del complemento. La actividad de trans-sialidasa, ha sido detectada hasta el momento sólo en T. cruzi y en dos parásitos tripanosomátidos emparentados, T. brucei y Endotrypanum sp. En algunos otros tripanosomátidos se han encontrado sialidasas, pero sin actividad de transferasa detectable, como en el caso de T.rangeli. Hasta ahora no se sabía si la sialidasa de este parásito no patogénico, estaba relacionada con la trans-sialidasa. Con el objetivo de comprender el(los) mecanismo(s) en el(los) que la trans-sialidasa está involucrada, en relación con la interacción huésped/parásito, en este trabajo de Tesis se ha avanzado en distintos aspectos del estudio molecular de la trans-sialidasa de T. cruzi y la sialidasa de T. rangeli: 1. Se optimizaron los sistemas de expresión y purificación de la trans-sialidasa recombinante con el fin de obtener grandes cantidades de proteína >95% pura. 2. Se utilizó trans-sialidasa recombinante pura como material inicial para cristalizar y comenzar estudios cristalográficos por difracción de rayos X, tendientes a resolver la estructura tridimensional de la misma. Además de las variaciones convencionales en los métodos y condiciones de cristalización, y mientras no se obtengan cristales adecuados, se procedió a buscar la separación de dominios parciales de la proteína para cristalizar de forma independiente. 3. En paralelo con los puntos anteriores, se demostró que la sialidasa de T rangelí es homóloga a la trans-sialidasa dc T. cruzi. Para ello se purificó la sialidasa nativa a partir de sobrenadantes de cultivo de T. rangeli, se microsecuenció y se logró clonar trece genes homólogos, miembros de lo que hemos denominado la familia multigénica de la sialidasa de T. rangeli. 4. Tres de los genes clonados codifican proteínas recombinantes con actividad de sialidasa comparablea la de la enzima nativa cuando se expresan en Escherichia coli. Uno de ellos fue secuenciadocompletamente, revelando una identidad en aminoácidos de 68.9% cuando se lo compara con la trans-sialidasa de T. cruzi, aumentando a una similitud dc 86.7% si se admiten sustituciones conservativas. 5. Se cristalizó la enzima nativa de T.rangeli sola y ligada a un inhibidor competitivo. Se resolvió su estructura tridimensional a partir del patrón de difracción de rayos X, hasta una resolución de 2.2Å. En paralelo se resolvió la estructura tridimensional de la misma proteína acomplejada al inhibidor hasta 2.9Å. 6. Se modelizó la estructura tridimensional de la trans-sialidasa, tomando como referencia inicial las coordenadas atómicas de la sialidasa, dada la gran homología entre las dos proteínas. 7. Se construyeron y expresaron moléculas quiméricas entre ambas enzimas con el objetivo de avanzar en la definición de regiones y/o residuos claves en la transglicosilación.