Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa - Santos, Javier (2004)
Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la informaciónexistente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo selleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye lainformación 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado deestructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estosúltimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuidahomogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existenfragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegadofinal, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de laestructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden serremovidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βLcomo modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteínacorrectamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aúnen trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no poseepuentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es unmodelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topologíamedianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de laestructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vistacinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas tambiénse estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas atal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegadopor GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmenteplegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantespara el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estadosparcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructuradoen dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización nocoincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos escompatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de laβ-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar lainterdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por lahélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizarontres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados debacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario,dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14,demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirirestructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia deresiduos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia noimpide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, queestá conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructurasecundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulofundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad dereplegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuoseliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampascinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través delestado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literaturareferidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan unplegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que lacadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local enla secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían unpapel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que lacadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado.