Síntesis y caracterización de 2´-c-metilnucleósidos en aplicaciones de silenciamiento génico

• Autores: Pontiggia, Rodrigo Martín
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Iribarren, Adolfo Marcelo; Montserrat, Javier
• Materia: NUCLEOSIDOS; RIBOZIMAS; 2´-C-METILNUCLEOSIDOS; RECEPTOR DE ESTROGENO; RNAI; NUCLEOSIDES; RIBOZYMES; 2´-C-METHYLNUCLEOSIDES; ESTROGEN RECEPTOR; RNAI
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El presente trabajo se enmarca dentro del campo de los oligonucleótidos, más específicamente los empleados como silenciadores génicos. El uso de ácidos nucleicos en terapia antisentido posee dos limitaciones generales, su baja estabilidad en fluidos biológicos y su pobre biodistribución. Estos problemas pueden ser abordados mediante el uso de modificaciones químicas de los mismos. Según trabajos previos de nuestro laboratorio los 2'-C-metilnucleósidos (2CMNs) producen un aumento de la vida media de ribozimas cabeza de martillo cuando son incorporados en zonas simple cadena manteniendo niveles de actividad in vitro aceptables. En este contexto, el principal objetivo de este trabajo fue realizar la caracterización de los 2CMNs realizando ensayos en células con la ribozima cabeza de martillo modificada y estudiar la posible utilización de los 2CMN en aplicaciones doble cadena como siRNA. El primer paso consistió en el diseño de una ruta sintética que permitiera obtener los 2CMNs en forma eficiente y utilizando reactivos más económicos que los empleados en otras estrategias. Para poder preparar los oligonucleótidos a partir de los nucleósidos obtenidos fue necesario resolver problemas asociados a la protección de la posición 2'. Una vez realizado esto, se logró incorporar los 2CMN en oligonucleótidos de 12 monómeros de longitud para el estudio de las propiedades de hibrización y potencial uso en siRNA. Además, estas estructuras fueron modeladas y utilizadas en un estudio computacional que permitió conocer en detalle el impacto de la introducción de los 2CMN en una hélice doble cadena, justificando los resultados experimentales obtenidos. Para cumplir con el objetivo principal del trabajo, se diseñaron y sintetizaron ribozimas cabeza de martillo para reducir los niveles de expresión del receptor de estrógeno en células de cáncer de mamas, pudiendo cuantificar la relación actividad/resistencia en un contexto celular. La ribozima con 2'-C-metiluridina presentó mayores niveles de actividad que la no modificada, llegándose a observar el efecto en los niveles de receptor hasta 36 hs después de la transfección.
The present work can be included in the gene silencing oligonucleotide field. In general, oligonucleotide based technologies suffer two main drawbacks, low stability in biological fluids and bioavailability problems. According to previous research done in our laboratory 2'-C-methylnucleosides (2CMNs) are capable of increasing the half life of ribozymes when they are introduced in certain single chain positions. They have also shown to maintain acceptable activity levels in in vitro assays. These first experiments showed that is was possible to apply 2CMNs in an in vitro system. The main objective of this work is to further characterize 2CMNs, carrying out experiments with modified ribozymes in cells and studying their applicability in double stranded systems, with special interest in siRNA. To accomplish the main objective of the thesis different hammerhead ribozymes were designed and synthesized. They were successfully used to reduce the estrogen receptor alpha-transcription levels in breast cancer cells, finding that the ribozyme containing 2-C-methyluridine showed to be more active than the non modified ones; the activity was detectable up to 36 hours after the transfection. The first step consisted in finding a synthetic route which enabled the possibility of obtaining 2CMNs efficiently and using low price reagents. The synthesis of oligonucleotides using 2CMNs required to find a suitable protecting group for the tertiary 2'-alcohol. After solving these important tasks the building blocks were used to synthesize 12 mer oligonucleotides and used in melting point and circular dichroism experiments. These structures were simulated in silico and used to describe their properties.
Fil: Pontiggia, Rodrigo Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.