Participación de los neutrófilos en la gestación : efectos moduladores de las células trofoblásticas y el VIP - Calo, Guillermina (2018)
El mantenimiento de la homeostasis inmunológica durante el embarazo requiere múltiples circuitos de regulación a nivel local y sistémico que actúan en forma sincronizada desde el período post-implantatorio hasta el parto. Diversas poblaciones de células inmunes son reclutadas a la interfase materno-placentaria desde el inicio de la gestación y su función es modulada en gran medida por factores solubles y de contacto de las células trofoblásticas. Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases caracterizadas por distintos microambientes o perfiles predominantes. Una primera etapa proinflamatoria, asociada a los procesos de implantación y placentación temprana. Esta etapa involucra la ruptura del epitelio uterino, la invasión del endometrio por el blastocisto y la remodelación de los vasos maternos, necesaria para satisfacer la creciente demanda de oxígeno y nutrientes. Esta respuesta inflamatoria inicial está estrictamente controlada para mantener la homeostasis a través de la activación de respuestas antiinflamatorias y tolerogénicas. A continuación, pasadas las 14 semanas, se inicia la segunda fase con un cambio de perfil hacia uno predominantemente antiinflamatorio requerido para el crecimiento fetal. Finalmente, una tercera etapa mucho más corta en duración, se caracteriza por una respuesta proinflamatoria asociada al desencadenamiento del parto. Distintos mediadores solubles como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y hormonas regulan estos cambios de perfil, actuando sobre múltiples células blanco entre las cuales los monocitos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos T han sido extensamente estudiados. Entre los factores inmunomoduladores de síntesis local, es de particular interés el péptido intestinal vasoactivo (VIP), un péptido pleiotrópico que es sintetizado por células trofoblásticas, entre otras células de la interfase materno-placentaria. El objetivo de la presente tesis es investigar mecanismos celulares y moleculares que condicionan el fenotipo de los neutrófilos y su interacción con células trofoblásticas con especial foco en la participación del sistema VIP y sus receptores VPAC. Para abordar este objetivo se emplearon dos diseños principales, por un lado diseños in vitro con células humanas utilizando neutrófilos y monocitos de dadores sanos y líneas celulares derivadas de trofoblasto humano de primer trimestre (Swan-71 y HTR8-SVneo). Por otro lado, para profundizar en los efectos de VIP y sus receptores, se emplearon dos cepas de ratón genéticamente modificadas que no expresan los receptores VPAC1 o VPAC2 de dicho péptido. En primer lugar, demostramos que los neutrófilos humanos expresan ARN mensajero de los dos receptores VPAC1 y VPAC2. Observamos que el VIP y los medios condicionados de células trofoblásticas (MC) inhiben la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) inducidas por el forbol miristato acetato (PMA), con disminución en la liberación de ADN y elastasa. Esta disminución en la NETosis es acompañada por un aumento de la apoptosis. Más aún, vimos que el VIP y los MC inhiben la liberación de mieloperoxidasa inducida por PMA. Hallamos que el VIP y los MC de las dos líneas trofoblásticas Swan-71 y HTR8 disminuyen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por el PMA. A su vez, los efectos inhibitorios de liberación de ROS y ADN fueron prevenidos por un antagonista de receptores de VIP. Demostramos que tanto el VIP como los MC inhiben parcialmente la autofagia inducida por PMA. Por otra parte, el VIP y los MC aceleran la apoptosis espontánea de neutrófilos y revierten el efecto antiapoptótico del LPS. En cuanto al papel del VIP trofoblástico, observamos que los MC de células trofoblásticas deficientes en VIP no inducen el efecto proapoptótico sobre los neutrófilos. Asimismo, se observó una mayor fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por monocitos cuando los primeros habían sido cultivados con MC, comparado con aquellos incubados en RPMI. En la segunda parte de la tesis, estudiando las cepas deficientes en los receptores VPAC1 y VPAC2, encontramos que las cruzas VPAC1 KO x VPAC1 KO tienen una menor cantidad de crías al nacer, y la cruza VPAC2 KO x VPAC2 KO presenta la misma tendencia. También vimos en ambas cepas una asimetría marcada en la distribución de los sitios a lo largo del útero. Estos sitios presentan una menor expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ambas cruzas y las células trofoblásticas gigantes aisladas de los sitios tienen expresión alterada de factores relacionados con la angiogénesis: VEGF, angiopoyetina 1 y metaloproteinasa 9. Los sitios de implantación también presentan una alteración en factores relacionados a la regulación de la respuesta inmune como la proteína quimioatrayente de monocitos 1, el marcador F4/80 y el factor plaquetario 4. Finalmente, al aislar neutrófilos de hembras VPAC1 y VPAC2 knock out preñadas observamos que tienen alterada su tasa de apoptosis y su capacidad de modular estímulos activadores como el PMA. Los macrófagos también presentan diferencias en su perfil. Concluimos que factores liberados por las células trofoblásticas inhiben la activación de los neutrófilos y promueven su apoptosis. Los resultados indican que, entre dichos factores, el VIP liberado por las células trofoblásticas tiene un papel relevante y que otros factores producidos por estas células a través de mecanismos mediados por el VIP endógeno, también contribuyen a la desactivación.