Bioactividad y toxicidad de componentes de aceites esenciales vegetales, en Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) resistentes a insecticidas piretroides - Toloza, Ariel Ceferino (2010)
Los piojos de la cabeza, Pediculus humanus capitis De Geer (Phthiraptera: Pediculidae) son ectoparásitos obligados de humanos. La infestación con piojos produce irritación de la piel, prurito y riesgo de infecciones secundarias como consecuencia del rascado. El control químico de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas clorados (DDT y lindano), organofosforados (malatión), carbamatos (carbaril), piretrinas naturales y piretroides (deltametrina, permetrina, d-fenotrina). Actualmente el uso de estos insecticidas está limitado por el desarrollo de poblaciones de piojos resistentes. Una alternativa a los insecticidas convencionales son los compuestos botánicos tales como los aceites esenciales (AE) de plantas aromáticas y sus componentes, los cuales han despertado alto interés por su actividad adulticida, ovicida y repelente en varios insectos plaga. Los objetivos planteados en esta tesis fueron: a) establecer la actividad biológica de los vapores de aceites esenciales y de sus componentes provenientes de plantas autóctonas y exóticas que crecen en Argentina sobre poblaciones de huevos y adultos de piojos resistentes a piretroides; b) analizar el efecto repelente de los mencionados aceites; y c) estudiar los mecanismos involucrados en el modo de acción y el rol de las enzimas monooxigenasas en la toxicidad de los monoterpenoides sobre piojos de la cabeza. Los piojos utilizados se recolectaron mediante el uso de peine fino de cabezas de niños de entre 3 y 13 años provenientes de escuelas primarias de Buenos Aires. Los 49 aceites esenciales fueron colectados en diversas regiones de Argentina durante la primavera de los años 2003-2004 y 2006-2007. Los 26 monoterpenoides estudiados en esta tesis fueron de origen comercial. Previo al estudio del efecto insecticida de los AEs, se determinó el grado de pediculosis (presencia de al menos una forma viable de piojo) y los niveles de resistencia a permetrina de las poblaciones a estudiar. Para el estudio de la fase vapor de los AEs y de los monoterpenoides sobre las liendres y sobre los adultos, se empleó una cámara cerrada que permitió la liberación progresiva del aceite o componente puro. En el caso de las formas eclosionadas, se midió el volteo de los piojos cada 5 min durante 1 h, y luego se calculó el tiempo de volteo necesario para afectar el 50% de los piojos (TV50). Con respecto a las liendres, las mismas fueron expuestas durante 24 hs al vapor de las sustancias en estudio y se registró el porcentaje de mortalidad (%). La actividad repelente de los AEs y de los monoterpenoides fue medida sobre una arena experimental concéntrica diseñada para este estudio. Se midió el porcentaje de insectos que estaban en el área tratada y control, y se calculó el índice de repelencia (IR). Con respecto a la medición enzimática de la actividad de acetilcolinesterasa (AChE), la misma fue determinada por un método espectrofotométrico y cinético. En primer lugar se estudió el efecto de los monoterpenoides sobre la inhibición de la AChE de anguila eléctrica. Luego se calculó la concentración de inhibición al 50% (CI50) del compuesto más efectivo usando las enzimas de AChEs de anguila eléctrica y la extraída a partir de homogenatos de piojos. Posteriormente, se expusieron piojos a los vapores del compuesto más efectivo y a los de un compuesto organofosforado volátil (diclorvos-DDVP-) del que se conoce su gran poder inhibitotio sobre la actividad de acetilcolinestarasa. Para analizar el posible rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de monoterpenoides, se topicaron las formas post-embrionarias de piojos con diferentes concentraciones del butóxido de piperonilo (PBO)- un conocido inhibidor de oxidasas-, y luego los piojos fueron expuestos a los vapores del monoterpenoide más efectivo y del compuesto organofosforado diclorvos-DDVP-. Los resultados demostraron un promedio de 29,7% de los chicos analizados tenían piojos, siendo encontrados más frecuentemente en las nenas que en los varones. Los grados de resistencia (GRs) de las poblaciones estudiadas de P.h.capitis variaron desde un 28,57 hasta un 71,42 (en comparación con la cepa de referencia susceptible de P.h.humanus). No se encontraron diferencias significativas en los valores de TV50 de las poblaciones con grados de resistencia diferentes. Esto sugiere que los mecanismos de resistencia a piretroides no afectan de manera prioritaria o directa a la toxicidad a los vapores de AEs y a sus componentes. En relación a al efecto fumígeno de los AEs sobre formas eclosionadas hay que mencionar que 24 de los 49 aceites estudiados (49%) produjeron un efecto tóxico sobre los piojos resistentes a permetrina. De estos aceites los más efectivos fueron aquellos obtenidos de plantas aromáticas autóctonas tales como Cinnamomun porphyrium, Myrcianthes cisplatensis, Aloysia citriodora (quimiotipo 2), Myrcianthes pseudomato, con valores respectivos de TV50 de 1,12; 1,29; 3,02 y 4,09 m. Estos aceites fueron entre 9 y 20 veces más tóxicos que los aceites que los precedieron. En relación a los compuestos monoterpenoides con mayor actividad fumígena sobre piojos, tenemos que destacar que el 1,8-cineol y el anisol fueron los más efectivos, con TV50s de 11,1 y 12,7m. Luego estuvieron los compuestos limoneno, 1S-(-)-α- pineno, β-pineno, (+)-α-pineno, linalol, mentona, α-pineno, pulegona, β- mirceno y alcohol bencílico. El TV50 del control positivo DDVP (un conocido fumigante) fue de 40,15 m y fue menos efectivo significativamente que los compuestos más efectivos, tales como el 1,8-cineol, el anisol y el limoneno. Se halló una correlación significativa entre los valores de TV50 y la presión de vapor de estos monoterpenoides, indicando que las sustancias más efectivas son las que poseen mayor presión de vapor. Cuando se profundizó en el estudio de aceites esenciales modificados genéticamente (híbridos de Eucaliptos), se halló que los híbridos Eucalyptus grandis X Eucalyptus camaldulensis y Eucalyptus grandis X Eucalyptus tereticornis produjeron mayor volteo (TV50= 13,6 y 12,9m) que sus formas parentales con TV50s de 25,6; 31,3 y 35m. Además, se halló una correlación significativa entre el porcentaje de 1,8-cineol y el TV50 de los mismos. Con respecto a la toxicidad de los monoterpenoides sobre los embriones hay que destacar que los compuestos más efectivos y de manera similar fueron el 1,8- cineol, anisol, el α-pineno, el β-pineno, el (+)-α-pineno, el 1S-(-)- α-pineno, el anetol, la carvona, el limoneno y el linalol. Esto es similar a lo observado para formas eclosionadas. En relación con la repelencia, el aceite esencial que produjo mayor repelencia sobre piojos de la cabeza fue el obtenido de la planta exótica Mentha pulegium y no difirió significativamente del control positivo piperonal. El compuesto con mayor efectividad repelente fue el alcohol bencílico con un índice de repelencia promedio de 57,74%, seguido de (-)-mentol, mentona y (+)-mentol con valores de IR respectivos de 53,56; 39,23 y 36,45%. Las lactonas estudiadas tuvieron efecto repelente en valores similares al control positivo. Con respecto a la actividad enzimática de acetilcolinestarasa medida sobre anguila eléctrica, se encontró diferencias significativas entre los 20 monoterpenoides, siendo el 1,8-cineol el que mayor inhibición produjo con un valor de CI50=6x10־³M. EL 1,8-cineol produjo inhibición de AChE obtenida de piojos, con una CI50=7,7x10־²M. Cuando se estudio la actividad sintomatológica de intoxicación del 1,8-cineol y del organofosforado DDVP, y se procedió a medir la inhibición de la AChE de piojos, se encontró que el 13% de la AChE estaba inhibida por el 1,8-cineol, mientras que el 80% de la enzima fue inhibida por el DDVP. Estos resultados demostraron relación entre la toxicidad del monoterpeno 1,8-cineol y la inhibición de la actividad AChE de piojos, y sugieren que habría otros mecanismos asociados a la sintomatología de volteo de piojos. El análisis del rol de las oxidasas de función mixta mostró una relación creciente entre la dosis subletal topicada con butóxido de piperonilo (PBO) y el TV50 de los piojos expuestos a los vapores del 1,8-cineol y del DDVP. Esto indica la importancia de este complejo enzimático en la degradación del monoterpeno 1,8-cineol. Para finalizar, hay que resaltar que es la primera vez que se realiza un estudio de toxicidad y repelencia de aceites esenciales obtenidos de plantas aromáticas de Argentina (y de sus componentes), sobre piojos resistentes a permetrina. Adicionalmente estos resultados aportan información para avanzar en el conocimiento del efecto de los monoterpenoides sobre la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, y del rol de las enzimas monooxigenasas en la degradación de dichos compuestos.