Sistemas de transporte de aminoácidos neutros en Saccharomyces cerevisiae, cepas silvestres y mutantes transporte-defectivas - Chianelli, Mónica Silvia (1998)
Evidencias cinéticas y genéticas muestran que en Saccharomyces cerevisiae, la incorporación de losaminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina es mediada por al menos tressistemas funcionalmente distintos: la permeasa general de aminoácidos GAP1 (inactiva en presencia deiones amonio) y dos sistemas de transporte más específicos S1 y S2, previamente descriptos para eltransporte de L-Leucina. En celulas silvestres cultivadas en medio conteniendo L-prolina, cada uno de los aminoácidos decadena ramificada exhibe un solo sistema de transporte de alta afinidad y muy alta capacidad. Unamutante gap1 muestra dos sistemas de transporte para Leucina con valores de KT y Jmáx similares aaquellos descriptos previamente como S1 y S2, y un solo sistema de transporte de baja afinidad- altacapacidad para isoleucina o valina. Una cepa mutante defectiva en los sistemas S1 y S2 quetransportan Leucina fue aislada a partir de la parental ya deficiente en la permeasa general deamingácidos, GAP1. La mutante fue seleccionada como una cepa espontánea resistente a triflúorleucina (TFL). Esta mutante fue cruzada con una cepa testigo gap1, y el análisis de tetradas indicó que laresistencia completa a TFL dependió de la presencia de al menos dos genes mutantes no ligados,denominados let (leucine transport). La mutación let1 inactiva completamente el sistema de transportede Leucina de alta afinidad-baja capacidad definido cinéticamente como S1. Aunque la mutación let2causó una marcada disminución en la Jmax del sistema S2 de baja afinidad, el transporte residual de Leucina en la mutante gap1let1let2 tuvo el mismo KT que el de la cepa parental gap1LET1LET2. Resultados similares se obtuvieron para los únicos sistemas de transporte de isoleucina o valina. Lamutante gap1let1let2 exhibió una marcada disminución en el crecimiento sobre medio minimoconteniendo Leucina, isoleucina o valina como únicas fuentes de nitrógeno. Además, la asimilación demetionina, fenilalanina, serina, treonina y norleucina estuvo impedida severamente, mientras losaminoácidos básicos y ácidos sostuvieron un crecimiento normal. Esto indica que al menos una de laspermeasas de Leucina tiene una considerablemente amplia pero aún limitada especificidad. La reversióndel gen gap1 restauró el transporte de los aminoácidos de cadena ramificada. La cepa revertante fuesensible a TFL cuando creció en prolina, pero resistente cuando amonio fue la fuente de nitrógeno. La segregante (sensible a TFL) gap1let2 exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadenaramificada, solamente un sistema de transporte de alta afinidad-baja capacidad. Esta cepa mostróparámetros cinéticos para el transporte de Leucina muy similares a aquellos caracterizados para elsistema S1 en la cepa gap1. Cada uno de los sistemas de transporte de alta afinidad de losaminoácidos de cadena ramificada es inhibido competitivamente por los otros dos aminoácidos decadena ramificada. Además, metionina, norleucina y TFL actúan como inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema de alta afinidad. En la mutante gap1let2 la deficiencia en laactividad de S2 resulta en la perdida de la capacidad de crecer significativamente en medios de cultivoconteniendo treonina, serina y norleucina como únicas fuentes de nitrógeno y un crecimiento reducidosobre los aminoácidos de cadena ramificada individuales, metionina y fenilalanina. Por lo tanto, el gen LET1 codifica la permeasa de L-aminoácidos de cadena ramificada de alta afinidad-baja capacidad S1,y posiblemente transporte también metionina y -fenilalanina. La permeasa LET1 (St) es primariamenteresponsable de la acumulación intracelular de TFL a niveles tóxicos, porque este sistema no esdetectable en la mutante resistente a TFL gap1let1let2. En contraste, la segregante gap1/eN exhibiópara cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada solamente un sistema de transporte de bajaafinidad- alta capacidad. Esta cepa mostró para el transporte de Leucina un valor de KT muy similar aaquel caracterizado para el sistema S2 en la cepa gap1 aunque con un valor de Jmax mas alto. Un únicosistema de transporte de baja afinidad -alta capacidad para isoleucina o valina mostró similarescaracterísticas. Esta cepa crece normalmente como la cepa gap1 sobre todas las fuentes de nitrógenoensayadas. Isoleucina, valina, metionina, alanina y norleucina son inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema S2. Los valores de Ki están en el orden de los valores de KTdeterminados para el transporte de Leucina, isoleucina y valina. DL-TFL es un inhibidor competitivo delsistema S2 pero el valor Kies más grande que el valor de KTpara el transporte de Leucina. Por Io tanto.el sistema S2 de baja afinidad- alta capacidad tiene una relativamente amplia especificidad.transportando no sólo los aminoácidos de cadena ramificada sino también metionina, alanina, serina.treonina y norleucina. Estos resultados sugieren que el gen LET2 codifica un componente asociado a laóptima actividad del sistema S2. La regulación de la actividad de transporte por la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivoindica que la permeasa LET1 (S1) no está sujeta a la represión catabólica por nitrógeno ni a lainactivación catabólica por nitrógeno (NCI). En contraste, en la cepa gap1 la actividad de transporte de L-leucina por S2 es regulada negativamente por los iones amonio. Más aún, en esta condición, eltransporte de L-leucina por el sistema S2 en las cepas gap1 y gap1let1let2 exhibió parámetros Cineticossimilares. En la segregante gap1/en el comportamiento regulatorio fue diferente. Las activdades detransporte de los aminoácidos de cadena ramificada por S2 fueron más altas que aquellas obtenidas enlas células mutantes gap1 o gap1let1let2 crecidas en los medios de cultivo conteniendo L-prolina oiones amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Estos resultados sugieren una tercera mutaciónademás de let1 y let2 que podría interferir con la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificadao de una interacción entre los productos de los genes LET1 y LET2.