Exploración de métodos de diagnóstico de resistencia y desarrollo de drogas a partir de la información contenida en el genoma de Mycobacterium tuberculosis - Castello, Florencia Andrea (2022)
Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con el agente causal de la tuberculosis (TB), Mycobaterium tuberculosis (Mtb). En nuestro país alrededor de 10.500 nuevos casos de TB son notificados anualmente, con cerca de 1.000 decesos anuales. La TB continúa siendo a la fecha una de las principales causas de mortalidad en el mundo. El genoma de Mtb se encuentra completamente secuenciado y tiene una longitud de 4,4 millones de pares de bases, codificando aproximadamente 4.000 genes. La mayor parte de los casos de TB en el mundo ocurren en países de bajos y medianos ingresos, donde muchos de los casos no son diagnosticados y tratados de manera correcta. El tratamiento se complica aún más con la existencia de cepas resistentes. Aunque las mismas suelen tratarse y resolverse con una terapia estándar con al menos 3 antibióticos diferentes durante 6-9 meses, la aparición de cepas multi-resistentes (MDR) y extremadamente resistentes (XDR) son un problema serio para los sistemas de salud. Argentina no está exenta de la aparición de éstas cepas, y se han reportado varios casos y evaluado terapias alternativas para su tratamiento. Las cepas bacterianas patógenas resistentes a diversos antibióticos son un problema de interés global. Aunque bacterias resistentes a algunos antibióticos ya han sido documentadas desde el principio del uso de estas sustancias, actualmente existen bacterias capaces de resistir a gran parte de las drogas disponibles. Identificar, caracterizar y desarrollar nuevos antibióticos es primordial para atacar esta problemática. La aplicación de herramientas moleculares ha llevado a aceptar que la infección producida por Mtb es más heterogénea que lo que se consideraba tradicionalmente. Habitualmente, la susceptibilidad y resistencia a los distintos fármacos utilizados para el tratamiento de la infección con Mtb se determina fenotípicamente, en base a la inhibición del crecimiento de la bacteria en presencia de un antibiótico. Su principal inconveniente es que se necesita entre 4 y 8 semanas desde la obtención de la muestra clínica para la obtención del resultado, con la consecuente demora en el inicio de un tratamiento adecuado. Un grupo novedoso de técnicas para determinar la sensibilidad a drogas de las micobacterias son las técnicas moleculares, que, en cambio, tienen por objetivo detectar mutaciones que confieran resistencia y que cuentan con la ventaja de la rapidez y son altamente sensibles y específicas, pero suelen ser caras y también requieren de personal altamente calificado. En este contexto, existe una necesidad apremiante de mejorar los métodos de diagnóstico de resistencia a antibióticos, que sean rápidos y económicos, que puedan ser aplicados en países en vías de desarrollo donde la incidencia de la TB es alta, combinando velocidad, sensibilidad, especificidad y bioseguridad. Con esta premisa, el presente trabajo tuvo como principal objetivo el diseño, programación, testeo y aplicación de protocolos de trabajo (pipelines) para el análisis de proteomas de organismos con diversos niveles de complejidad. El presente trabajo se centrará en el desarrollo de una herramienta capaz de predecir compuestos activos para combatir tuberculosis utilizando la base de datos ChEMBL (EMBL-EBI). Se programaron pipelines para analizar y obtener posibles ligandos para cada proteína expresada en el proteoma bacteriano usando como referencia Mtb. Cada pipeline fue organizado en forma modular, permitiendo iniciar el proceso desde el proteoma completo bacteriano obtenido por Uniprot, con la posibilidad de incorporar información procedente de fuentes diversas (PFam, PDB, ChEMBL, Zinc), combinandolas entre sı́, según el nivel de análisis que se necesite y la información de que se disponga. Paralelamente al proceso de desarrollo de los pipelines, se generaron nuevos módulos de análisis de secuencia para búsqueda de resistencias en muestras de Mtb. Para la puesta a punto de los mismos, se extrajo ADN de Mtb de muestras del de esputo de pacientes sensibles o resistentes a alguna de las drogas de primera o segunda línea de antibióticos de acción contra TB según ensayos fenotípicos in vitro. Los genomas fueron obtenidos mediante la técnica de Whole Genome Shotgun (WGS). El análisis bioinformático de las secuencias permitió contar con una herramienta con estimadores de calidad elevados (mayores al 90% para drogas de primera línea) de determinación de perfiles de susceptibilidad tanto en pacientes permitiendo hacer un seguimiento epidemiológico de las cepas y su evolución en cepas resistentes (MDR y XDR).