Glicoconjugados de Trypanosoma Cruzi : caracterización de sialoglicolípidos - Confalonieri de Ozdy, Adriana Norma (1987)
El presente trabajo de tesis tuvo por objetivo principal, laidentificación y caracterización de glicoconjugados, en especialsialoglicolípidos del trypanosomatideo Trypanosoma cruzi. Esteprotozoario es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Se presentan: 1) Una introducción referida a la clasificación general de losprotozoarios, y en particular a los de la familia Trypanasomatidae. Se reseñan las características morfológicas del T. cruzi y su ciclo de vida, así como la forma en que se cultiva axénicamente el parásito. 2) Un resumen sobre la estructura, ocurrencia, función y biosíntesisde los glicoesfingolípidos y gangliósidos de animalesvertebrados y una referencia sobre los que se han encontrado últimamenteen invertebrados. 3) Los estudios realizados sobre los glicoconjugados componentesde membrana de formas epimastigote de T. cruzi. 4) Los antecedentes que evidenciaban la presencia de ácido siálicoen T. cruzi. 5) La interpretación y discusión de los resultados que incluye A) La diferenciación de las distintas fracciones subcelularesde epimastigotes de T. cruzi (cepa Tulahuén) en base a: i) el análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida delos glicoconjugados presentes en las mismas.ii) Las características químicas, que incluyen la determinaciónde proteína y azúcar, la composicion de monosacáridos y la determinaciónde la ausencia de glucógeno en las mismas, el cualse ha descripto como material de reserva para otros protozoarios. B) La marcación exógena de la membrana plasmática de dos líneasde la cepa Tulahuén (Tul Ø y Tul 2). Se determinó la diferentecomposición de glicoconjugados de membrana para las doslíneas, la cual difiere también de la cepa Y. En Tul Ø la marcase incorpora principalmente en la glicoproteína de 45 kDa (Gp45)mientras que en Tul 2, se incorpora también en una glicoproteínade 25 kDa. C) Estudios estructurales comparativos realizados sobre Gp45de Tul Ø y el complejo glicoproteico ABC, de cepa Y. Para ellose aislaron las glicoproteínas de extractos fenol-agua y sedeterminaron los monosacáridos componentes . Se realizó una hidrólisis alcalina en condiciones de β- eliminación, de las glicoproteínas previamente marcadas con galactosaoxidasa NaBͽH4, y se determinó que en Gp45 y en el complejo ABC, existen oligosacáridos de 4 a 7 unidades de azúcar unidos através de unión O-glicosídica a la proteína, y que poseen galactosacomo uno de sus componentes. Además se determinó la presenciade cadenas unidas a la proteína por otro tipo de unión, aunqueno se confirmó la naturaleza de la misma. D) Se realizó un extracto lipídico de las células epimastigotede T. cruzi, el cual se reextrajo con KCl. En este últimoextracto se determinó la presencia de por lo menos dos componentesque revelaban con reactivo de gangliósidos. Se dosaron 1Ø¹²/²moléculas de ácido siálico / célula, que se liberan del extractopor acción de neuraminidasa. Se determinó también la presenciade azúcar, esfingosina y ácidos grasos en la misma. E) El análisis por EGPA, de epimastigotes marcados con la técnicade NaIO4- NaBͽH4, mostró la incorporación de la radioactividaden dos glicoconjugados, el LPPG (Banda D) y en una bandade alta movilidad (Banda E). Esta última se extrajo con solventepara lípidos, y con KCl. Por fraccionamiento con columna de sílica gel H, de un extracto C:M (2:1) marcado, se obtuvieron dosfracciones A y B. En la fracción A se liberó un 35% de la radioactividad por la acción de la neuraminidasa, mientras que en la B, la marca se incorporaba como arabinosa, lo que sugiere la presencia de galactofuranosa en la misma. F) Se llevó a cabo una incorporación metabólica de (ͽH) ácidopalmítico y (ͽH)-galactosa a las células. Se aislaron dos glicolípidosque incorporan ambos precursores (G1Tc y G2Tc). El ácido palmítico se incorporó en una esfinganina en G1Tc yen una esfingenina en G2Tc. Ambos glicolípidos cambiaban su movilidad en c.c.d. por laacción de la neuraminidasa, por lo que se trata de sialoglicoesfingolípidos. Se demostró la naturaleza endógena de los mismos así como también la de los glicoconjugados A, B, C y D. 6) Se aislaron los glicoesfingolípidos G1Tc y G2Tc de un extracto C:M (2:l) de 1Ø¹² células. Para ello se utilizó en primerlugar una resina DEAE-Sephadex en la que se separaron los lípidos neutros de los acídicos. Estos últimos se fraccionaron porcolumna de Unisil, recogiendo las fracciones que eluían con C:M (8:2) y C:M (1:1). Esta última se recromatografió en una columna decaracterísticas similares, obteniéndose los dos gangliósidos. H) En la fracción C:M (8:2), se analizaron los ácidos grasos,los azúcares, y las esfingosinas presentes. No se detectó ácido siálico. Del análisis de las distintas c.c.d realizadas sobre extractosprovenientes de las marcaciones con ácido palmítico, galactosa, IO4- NaBͽH4 y de las reveladas con reactivos para fósforo yglicolípidos se dedujo que en la misma están presentes por lo menos un glicolípido que se marca con IO4-NaBͽH4 por poseergalactofuranosa, un fosfoglicolípido y fosfolípidos. I) Se analizó la composición de los gangliósidos. Para G1Tc se determina que la relación azúcares neutros: aminoazúcares:ácido siálico: esfingosina es: 4:1:1:1, mientras quepara G2Tc la relacion es Azúcares neutros: ácido siálico: esfingosina 5:1:1. Se realizaron hidrólisis ácidas específicas sobre la cadenadel oligosacárido de G1Tc. Se determinó que está compuesta por Glucosa:manosa:arabinosa:galactosamina:ácido siálico en relación 2:1:1:1:1. Esta composición es distinta a la de todos los gangliósidosconocidos. Por otra parte éste es el primer informesobre la presencia de galactosamina en T. cruzi. Los componentes de la ceramida de G1Tc se aislaron por metanólisis y extracción de los ácidos grasos y las esfingosinas, lasque se analizaron por c.g.l-e.m. Se determinó que la base de cadena larga presente en G1Tces una metil esfinganina ramificada de 19 átomos de carbono, lacual se halla esterificada por ácidos grasos en cuya composiciónse encuentran principalmente ácido 2-metil esteárico (44%), Ac.esteárico (31%), ac. 2-metil palmítico (6,3%), Ac. palmítico (7,3%) y ac. oleico (4,6%). Los ácidos 2-metil ramificados nohabían sido informados como componentes de extractos lipídicosde T. cruzi. Por marcación con galactosa oxidasa NaBͽH4, se determinóque la radioactividad se incorpora en galactosamina en G1Tc y engalactosa en G2Tc, lo que descarta también la unión de ambosmonosacáridos por el C-6 al oligosacárido respectivo. Asimismo se marcaron los dos gangliósidos con IO4- NaBͽH4. La radioactividad liberada por hidrólisis acida y enzimática, fuela misma en ambos casos, por lo que se concluye que el ácidosiálico se encuentra terminal. La movilidad de los gangliósidosmarcados es similar a la del gangliósido GM1, lo cual confirmaque son monosialilgangliósidos. También se ratificó el cambio enel Rf de los mismos, cuando son tratados con neuraminidasa. Se llevó a cabo una oxidación con periodato de G1Tc. Por c.g.l. se determinó la presencia de sorbitol: glicerol y treitolen relación 2,1:Ø,25, lo que indica que la glucosa no fué oxidada. La presencia de treitol podría deberse a residuos de galactosamina no N-acetilada unida en posición 4. Por metilacidn de G1Tc se determinó que la manosa se halla 2-O-sustituida, confirmando la relación en que se encuentran elglicerol con el sorbitol (1:2), en el análisis de los productosde la oxidación con periodato. Se analizó la composición de la ceramida de G2Tc, utilizandolas mismas técnicas que para G1Tc. Se determinó la presencia deesfingosina unida a ácidos grasos en cuya composición se encuentran principalmente ácido 2-metil palmítico (27,1%), ac. 2-metil esteárico (22,6%), Ac. 2-metil araquídico (9,6%), Ac. esteárico (13,3%) y ac. palmítico (9,7%). Los monosacáridos componentes de G2Tc son arabinosa, manosa, galactosa y glucosa. El tratamiento con β-galactosidasa de G2Tc desialidado liberógalactosa, indicando que el ácido siálico terminal se encuentra unido a galactosa, como es común en gangliósidos animales. J) Del extracto lipídico total se aisló un plasmalógeno, porpasaje a través de columna de Unisil y posterior separación delos lípidos más polares por c.c.d. preparativa. El plasmalógeno (PLTc) se hidrolizó con ac. acético y se separóel aldehído del lisofosfolípido por columna de Unisil. Por c.g.l.-e.m. del aldehído reducido al alcohol se determinó la presenciade hexadecanal. El lisofosfolípido se saponificó y se analizaronlos ácidos grasos. Por hidrólisis fuerte del plasmalógeno y análisis por c.p. se determinóla presencia de etanolamina. A su vez se dosó el contenidode fosfato en PLTc, que corresponde a un mol de fosfato pormol de plasmalógeno. La movilidad en c.c.d. es similar a la informada para plasmalógenos derivados de fosfatidiletanolamina,por lo que se concluyó que la estructura de PLTc es la representadaen la fig 47.