Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing

Autores
Pozzi, María Berta
Año de publicación
2017
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Srebrow, Anabella
Descripción
La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exones flanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejo ribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicas de cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que se ensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cada región del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que el factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo una actividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexión entre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podría modular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejos spliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamos que las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, no interacciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente de la conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles de eficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren que esto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgos proponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma.
Most eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II give rise to immature messenger RNA or precursor mRNAs (pre-mRNAs) containing exons and introns. The splicing process isresponsible for removing introns and joining exons generating mature mRNAs. This processis carried out by the spliceosome, a multi-mega-dalton ribonucleoprotein complexcomprised by five particles termed “snRNPs” (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated factors. Each snRNP is formed by a small nuclear RNA (snRNA), a common set of Sm or LSm proteinsand a variable number of particle-specific proteins. The spliceosome does not exist as such inthe cell nucleus but assembles de novo from its components, in a precise step-wise manner,on every region in the pre-mRNA that has to be removed by the recognition of splicing sites. Previous work from our laboratory demonstrated that the splicing factor SRSF1 is also aregulator of the SUMOylation pathway, displaying an E3 ligase-like activity. These results ledus to explore a possible conexion between the SUMO and splicing machineries,hipothesizing that SUMO conjugation might modulate the dynamics of the splicing processby affecting the interactions between proteins and between these and the RNA. In this work, we have found that addition of the SUMO protease SENP1 diminishes in vitrosplicing efficiency. On the other hand, mass spectrometry analysis of anti-SUMOimmunoprecipated proteins from purified spliceosomal complexes at different steps of thesplicing reaction allowed us to identify many spliceosomal proteins as SUMO substrates. Focusing on one of them, the protein component of the di-snRNP U4/U6 Prp3, we detectedits SUMOylation in cultured cells and, by site directed mutagenesis , found that lysines 289and 559 are SUMO conjugation sites within this protein. We further demonstrated that a Prp3 sumoylation-deficient mutant while still capable of interacting with U4/U6 snRNPcomponents is unable to co-precipitate U2 and U5 snRNA and the spliceosomal proteins U2- SF3a120 and U5-Snu114, unlike the wild type version of this protein. These results suggestthat U4/U6 snRNP assembly is independent of Prp3 SUMOylation. However, this PTM isnecessary for Prp3 interaction with those snRNPs to which it does not belong. Upondepletion of endogenous Prp3, this mutant fails to rescue the splicing efficiency of variouspre-mRNAs when transfected into cultured cells. Prp3 SUMOylation deficient mutant alsoshows a diminished recruitment to active spliceosomes, compared to the wild type protein,assessed by chromatin immunoprecipitaction analysis. These findings indicate that SUMOconjugation plays a role during the splicing process and suggest the involvement of Prp3 SUMOylation in U4/U6.U5 tri-snRNP formation and/ or recruitment.
Fil: Pozzi, María Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia
SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
SUMO
SRSF1
PRP3
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
Repositorio
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institución
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identificador
tesis:tesis_n6164_Pozzi

id BDUBAFCEN_4a11cba8326927eb43cf07d486a0ea02
oai_identifier_str tesis:tesis_n6164_Pozzi
network_acronym_str BDUBAFCEN
repository_id_str 1896
network_name_str Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
spelling Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicingParticipation of spliceosomal protein SUMOylation in the splicing processPozzi, María BertaSPLICEOSOMAMODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALESSUMOSRSF1PRP3SPLICEOSOMEPOSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONSSUMOSRSF1PRP3La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exones flanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejo ribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicas de cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que se ensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cada región del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que el factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo una actividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexión entre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podría modular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejos spliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamos que las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, no interacciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente de la conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles de eficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren que esto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgos proponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma.Most eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II give rise to immature messenger RNA or precursor mRNAs (pre-mRNAs) containing exons and introns. The splicing process isresponsible for removing introns and joining exons generating mature mRNAs. This processis carried out by the spliceosome, a multi-mega-dalton ribonucleoprotein complexcomprised by five particles termed “snRNPs” (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated factors. Each snRNP is formed by a small nuclear RNA (snRNA), a common set of Sm or LSm proteinsand a variable number of particle-specific proteins. The spliceosome does not exist as such inthe cell nucleus but assembles de novo from its components, in a precise step-wise manner,on every region in the pre-mRNA that has to be removed by the recognition of splicing sites. Previous work from our laboratory demonstrated that the splicing factor SRSF1 is also aregulator of the SUMOylation pathway, displaying an E3 ligase-like activity. These results ledus to explore a possible conexion between the SUMO and splicing machineries,hipothesizing that SUMO conjugation might modulate the dynamics of the splicing processby affecting the interactions between proteins and between these and the RNA. In this work, we have found that addition of the SUMO protease SENP1 diminishes in vitrosplicing efficiency. On the other hand, mass spectrometry analysis of anti-SUMOimmunoprecipated proteins from purified spliceosomal complexes at different steps of thesplicing reaction allowed us to identify many spliceosomal proteins as SUMO substrates. Focusing on one of them, the protein component of the di-snRNP U4/U6 Prp3, we detectedits SUMOylation in cultured cells and, by site directed mutagenesis , found that lysines 289and 559 are SUMO conjugation sites within this protein. We further demonstrated that a Prp3 sumoylation-deficient mutant while still capable of interacting with U4/U6 snRNPcomponents is unable to co-precipitate U2 and U5 snRNA and the spliceosomal proteins U2- SF3a120 and U5-Snu114, unlike the wild type version of this protein. These results suggestthat U4/U6 snRNP assembly is independent of Prp3 SUMOylation. However, this PTM isnecessary for Prp3 interaction with those snRNPs to which it does not belong. Upondepletion of endogenous Prp3, this mutant fails to rescue the splicing efficiency of variouspre-mRNAs when transfected into cultured cells. Prp3 SUMOylation deficient mutant alsoshows a diminished recruitment to active spliceosomes, compared to the wild type protein,assessed by chromatin immunoprecipitaction analysis. These findings indicate that SUMOconjugation plays a role during the splicing process and suggest the involvement of Prp3 SUMOylation in U4/U6.U5 tri-snRNP formation and/ or recruitment.Fil: Pozzi, María Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesSrebrow, Anabella2017-03-07info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzispainfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/arreponame:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)instname:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesinstacron:UBA-FCEN2025-09-29T13:42:01Ztesis:tesis_n6164_PozziInstitucionalhttps://digital.bl.fcen.uba.ar/Universidad públicaNo correspondehttps://digital.bl.fcen.uba.ar/cgi-bin/oaiserver.cgiana@bl.fcen.uba.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:18962025-09-29 13:42:02.306Biblioteca Digital (UBA-FCEN) - Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesfalse
dc.title.none.fl_str_mv Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
Participation of spliceosomal protein SUMOylation in the splicing process
title Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
spellingShingle Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
Pozzi, María Berta
SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
SUMO
SRSF1
PRP3
title_short Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
title_full Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
title_fullStr Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
title_full_unstemmed Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
title_sort Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing
dc.creator.none.fl_str_mv Pozzi, María Berta
author Pozzi, María Berta
author_facet Pozzi, María Berta
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Srebrow, Anabella
dc.subject.none.fl_str_mv SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
SUMO
SRSF1
PRP3
topic SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
SUMO
SRSF1
PRP3
dc.description.none.fl_txt_mv La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exones flanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejo ribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicas de cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que se ensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cada región del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que el factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo una actividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexión entre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podría modular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejos spliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamos que las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, no interacciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente de la conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles de eficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren que esto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgos proponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma.
Most eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II give rise to immature messenger RNA or precursor mRNAs (pre-mRNAs) containing exons and introns. The splicing process isresponsible for removing introns and joining exons generating mature mRNAs. This processis carried out by the spliceosome, a multi-mega-dalton ribonucleoprotein complexcomprised by five particles termed “snRNPs” (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated factors. Each snRNP is formed by a small nuclear RNA (snRNA), a common set of Sm or LSm proteinsand a variable number of particle-specific proteins. The spliceosome does not exist as such inthe cell nucleus but assembles de novo from its components, in a precise step-wise manner,on every region in the pre-mRNA that has to be removed by the recognition of splicing sites. Previous work from our laboratory demonstrated that the splicing factor SRSF1 is also aregulator of the SUMOylation pathway, displaying an E3 ligase-like activity. These results ledus to explore a possible conexion between the SUMO and splicing machineries,hipothesizing that SUMO conjugation might modulate the dynamics of the splicing processby affecting the interactions between proteins and between these and the RNA. In this work, we have found that addition of the SUMO protease SENP1 diminishes in vitrosplicing efficiency. On the other hand, mass spectrometry analysis of anti-SUMOimmunoprecipated proteins from purified spliceosomal complexes at different steps of thesplicing reaction allowed us to identify many spliceosomal proteins as SUMO substrates. Focusing on one of them, the protein component of the di-snRNP U4/U6 Prp3, we detectedits SUMOylation in cultured cells and, by site directed mutagenesis , found that lysines 289and 559 are SUMO conjugation sites within this protein. We further demonstrated that a Prp3 sumoylation-deficient mutant while still capable of interacting with U4/U6 snRNPcomponents is unable to co-precipitate U2 and U5 snRNA and the spliceosomal proteins U2- SF3a120 and U5-Snu114, unlike the wild type version of this protein. These results suggestthat U4/U6 snRNP assembly is independent of Prp3 SUMOylation. However, this PTM isnecessary for Prp3 interaction with those snRNPs to which it does not belong. Upondepletion of endogenous Prp3, this mutant fails to rescue the splicing efficiency of variouspre-mRNAs when transfected into cultured cells. Prp3 SUMOylation deficient mutant alsoshows a diminished recruitment to active spliceosomes, compared to the wild type protein,assessed by chromatin immunoprecipitaction analysis. These findings indicate that SUMOconjugation plays a role during the splicing process and suggest the involvement of Prp3 SUMOylation in U4/U6.U5 tri-snRNP formation and/ or recruitment.
Fil: Pozzi, María Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
description La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exones flanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejo ribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicas de cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que se ensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cada región del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que el factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo una actividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexión entre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podría modular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejos spliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamos que las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, no interacciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente de la conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles de eficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren que esto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgos proponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma.
publishDate 2017
dc.date.none.fl_str_mv 2017-03-07
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_db06
info:ar-repo/semantics/tesisDoctoral
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzi
url https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzi
dc.language.none.fl_str_mv spa
language spa
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
eu_rights_str_mv openAccess
rights_invalid_str_mv https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
publisher.none.fl_str_mv Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
instname:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron:UBA-FCEN
reponame_str Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
collection Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
instname_str Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron_str UBA-FCEN
institution UBA-FCEN
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital (UBA-FCEN) - Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
repository.mail.fl_str_mv ana@bl.fcen.uba.ar
_version_ 1844618716901277696
score 13.070432