Nanoscopía de fluorescencia con uso eficiente de fotones mediante el escaneo de mínimos de intensidad de luz - Masullo, Luciano Andrés (2021)
La microscopía de superresolución, o más exactamente las técnicas de nanoscopía de fluorescencia, han revolucionado la obtención de imágenes basadas en la fluorescencia alcanzando resoluciones en el rango nanométrico, mucho más allá del límite de difracción de la luz. El concepto clave es la conmutación de los fluoróforos entre un estado fluorescente y otro no fluorescente. Esta "conmutación on-off" permite la localización secuencial de un subconjunto de fluoróforos en la muestra con una precisión que supera el límite de difracción. La primera generación de nanoscopía de fluorescencia estaba compuesta por dos familias de técnicas: métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica. En los métodos dirigidos por coordenadas, como el Stimulated Emission Depletion (STED) o el REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT), el proceso de desconexión es inducido por la luz y la imagen superresuelta se obtiene mediante el barrido de un campo óptico espacialmente modulado que controla la depleción de los fluoróforos en posiciones predefinidas de la muestra. En cambio, los métodos de localización estocástica, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) o la microscopía de localización fotoactivada (PALM), utilizan una iluminación uniforme. En este caso, se obtienen imágenes de fluoróforos individuales y bien separados que se encienden y apagan estocásticamente en la muestra. La imagen superresuelta se reconstruye utilizando las posiciones de cada fluoróforo medido, que se obtienen a partir de los ajustes de sus imágenes individuales a la función de dispersión de puntos del microscopio. Estas técnicas están ahora bien establecidas con microscopios comerciales de varias empresas disponibles en el mercado. Aunque no existe un límite fundamental para la resolución espacial de estos métodos, en la práctica alcanzan entre 20 y 30 nm de resolución lateral debido al limitado número de fotones de fluorescencia detectables, impuesto principalmente por la fotodegradación de los fluoróforos. Naturalmente, es interesante alcanzar resoluciones más altas para acceder a la escala entre 1 y 20 nm. Especialmente interesante sería alcanzar el régimen de sub-10 nm, ya que ese es el tamaño típico de las proteínas estructurales. Por lo tanto, estos métodos permitirían estudiar las estructuras proteicas supramoleculares con resolución molecular en condiciones biológicamente compatibles. Por lo tanto, es interesante investigar las vías para conseguir métodos de nanoscopía de fluorescencia más eficientes con respecto a los fotones detectados. Recientemente, la técnica Maximally INFormative LUminescence eXcitation (MINFLUX) ha puesto en marcha una nueva generación de métodos de nanoscopía de fluorescencia que combina las ventajas de los métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica, para extraer la máxima información posicional de una única molécula utilizando un número mínimo de fotones. MINFLUX utiliza campos de excitación que comprenden un mínimo de intensidad para interrogar la posición de moléculas individuales y puede ofrecer de forma rutinaria una precisión de localización de ~ 1 nm. En esta Tesis, se presentan nuevos métodos eficientes en uso de fotones para localizar moléculas individuales con luz estructurada con un mínimo de intensidad. El Capítulo 1 describe los fundamentos de la microscopía de fluorescencia y la nanoscopía de fluorescencia. Se presentan los principios comunes subyacentes. Se revisan los diferentes tipos de técnicas de nanoscopía, incluidos los desarrollos más recientes, y se resume el estado de la técnica en este campo. En el Capítulo 2 se presenta el desarrollo de una versión paralelizada de la nanoscopía RESOLFT dirigida por coordenadas. Este microscopio utiliza una combinación de dos patrones de luz de campo amplio: una matriz de mínimos de luz y un patrón de focos múltiples. Este novedoso esquema de iluminación consigue una mayor sensibilidad al mejorar la detección de fotones y el rechazo del fondo, proporcionando la mejor combinación de campo de visión y resolución espacio-temporal reportada en microscopía de células vivas en el momento de escribir esta Tesis: 50 nm resolución lateral y tiempos de adquisición de 1 s para la obtención de imágenes de células enteras. El Capítulo 3 describe la localización de moléculas fluorescentes individuales mediante una secuencia de exposiciones a patrones de luz estructurada. Se discuten los trabajos anteriores en este campo y se desarrolla y describe un marco matemático común que utiliza la teoría de la Estimación de Máxima Verosimilitud (MLE). Este marco matemático sirve para comparar diferentes métodos y también facilita el diseño de nuevos esquemas experimentales. Como ejemplo, se proponen dos nuevos métodos de localización que combinan los puntos fuertes de los esquemas existentes. En el Capítulo 4 se presenta una implementación novedosa y simplificada del concepto de localización MINFLUX. A diferencia de la implementación original, p-MINFLUX utiliza pulsos láser intercalados para suministrar los focos de excitación de forma toroidal a una velocidad de repetición máxima, generando así un barrido efectivo a escala de nanosegundos de los mínimos de luz. Utilizando sistemas modelo de origami de ADN tanto estáticos como dinámicos, demostramos su efectividad para la nanoscopía de localización de moléculas individuales y el tracking o seguimiento, respectivamente. La precisión de la localización de 1 − 2 nm se consigue con 2000 − 1000 fotones. Además, p-MINFLUX proporciona acceso al tiempo de vida de la fluorescencia. Hemos aplicado esta información para adquirir señales multiplexadas discernidas por el tiempo de vida y para realizar microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) con una resolución de 3 − 4 nm (precisión de localización de 1 − 2 nm), que es una resolución al menos un orden de magnitud mejor que la reportada previamente en imágenes de tiempo de vida. En el Capítulo 5 se describe el desarrollo de un nuevo método de localización de moléculas individuales utilizando mínimos de luz. Al escanear un haz de luz que presenta un mínimo de intensidad (idealmente un cero) sobre una molécula individual fluorescente, la posición del emisor puede estimarse con precisiones equivalentes a MINFLUX o mejores. A diferencia del MINFLUX, que requiere montajes de gran complejidad técnica, este enfoque de escaneo rasterizado del mínimo de excitación puede implementarse directamente en cualquier microscopio de escaneo láser simplemente introduciendo un elemento óptico pasivo, como una placa de fase vortical, para obtener un foco en forma de toroide. Caracterizamos el rendimiento de este nuevo método mediante cálculos teóricos, simulaciones numéricas y experimentos de nanoscopía. Por último, las conclusiones de esta Tesis y las perspectivas a futuro se desarrollan en el Capítulo 6.