Ensayos de producción, caracterización enzimática y obtención de expolisacáridos de hongos comestibles lignocelulolíticos patagónicos en sustratos provenientes de desechos herbáceos, agrícolas y forestales - Rugolo, Maximiliano (2018)
Muchos de los hongos lignocelulolíticos de los bosques andino patagónicos poseen un alto valor culinario y, además de ser comestibles y nutritivos, presentan también propiedades medicinales; sin embargo, casi no han sido tenidos en cuenta en la Argentina debido a las dificultades para su cultivo y producción. Los hongos causantes de pudrición blanca son los únicos organismos capaces de degradar la lignina hasta su completa mineralización, lo cual hace de este grupo el único que posee todos los grupos de enzimas necesarios para degradar todos los componentes de la madera, siendo estas de interés para aplicaciones biotecnológicas. Los hongos de pudrición castaña remueven selectivamente celulosa y hemicelulosa de la pared celular, sin alterar mayormente la lignina. La explotación forestal de la región andino patagónica genera desechos de aserríos en gran proporción, en su mayoría de forestaciones de Pinus sp. y de maderas del bosque nativo, los cuales podrían ser aprovechados por estos organismos. Esta tesis aborda diferentes objetivos de estudio centrándose en los hongos comestibles degradadores de la madera y nativos de la Patagonia andina, siendo estos Pleurotus ostreatus, Grifola gargal, Grifola sordulenta, Fistulina antarctica y Fistulina endoxantha. Los mismos fueron coleccionados durante los otoños de 2013 y 2014 en bosques de Nothofagus dombeyii (coihue), Nothofagus obliqua (Roble Pellín) y Araucaria araucana, luego aislados en medios de cultivo tradicionales y, finalmente, preservados como cultivos puros para el trabajo de laboratorio. Se realizaron ensayos de crecimiento en placa de Petri a diferentes temperaturas, resultando la temperatura óptima de crecimiento miceliar para todas las cepas entre 20-23 ºC. Sin embargo, las tasas de crecimiento de Grifola (0,20 – 0,30 cm/día) y Fistulina (0,07 – 0,10 cm/día) fueron sumamente menores respecto a Pleurotus (0,8 – 1,0 cm/día). Grifola gargal y G. sordulenta presentaron actividad lacasa y celulasa, mientras que P. ostreatus presentó actividad lacasa, MnP y celulasa. En ninguna cepa se detectó actividad LiP positiva.. La decoloración de diferentes colorantes textiles (RBBR -Azul brillante de remazol R-, Xilidina, Verde de malaquita y Azure B) fue utilizada para corroborar la actividad enzimática. Pleurotus ostreatus decoloró todos ellos en las dos concetraciones ensayadas (10 y 50 μM), Grifola gargal y G. sordulenta mostraron degradación efectiva de todos los colorantes a 10 μM. Fistulina spp. degradaron ligeramente RBBR, xilidina y verde de malaquita en 10 μM. A partir de medios de cultivo líquido se realizó la cuantificación de la actividad enzimática. Grifola gargal presentó mayor actividad lacasa, con el máximo al día 45 en medio GPY, siendo de 0,100 UE/ml.. El cultivo líquido de P. ostreatus mostró el máximo de actividad entre el día 20 y 25, alcanzando 0,150 UE/ml. Por otro lado, se evaluó cualitativamente la degradación de diferentes especies forestales mediante técnicas de histoquímica. Con estos datos se pudo seleccionar a la lenga como el mejor sustrato para el cultivo en el caso de las especies de Grifola y Fistulina. No se observaron diferencias respecto a los sustratos usados por P. ostreatus. Gracias a la abundancia de desechos agrícola-forestales de la región, se realizaron formulaciones para la producción de las especies comestibles. El enfoque principal se realizó con las cepas de P. ostreatus que crecen naturalmente en Araucaria con el fin de aprovechar su adaptación a los sustratos resinosos y generar una producción sobre residuos de las plantaciones, aserraderos y/o plantas de procesamiento de Pinus sp., abundante por las forestaciones zonales. Se suplementó el material con residuos de las industrias vitivinícola y cervecera regionales. Las eficiencias biológicas (EB) obtenidas en virutas de pino resultaron superiores por parte de las cepas nativas respecto a la cepa comercial utilizada. Los otros sustratos ensayados fueron virutas de lenga, álamo y paja grámon, en los cuales la cepa comercial arrojó mayores EB. Para evaluar el crecimiento y la actividad lacasa frente a compuestos volátiles presentes en las resinas se cuantificó la biomasa fúngica del cultivo líquido y el diámetro de la colonia. El crecimiento fue menor en los tratamientos con limonelo y δ-3-careno, y prácticamente nulo con 4-carvomentenol, citronelol, y ρ-cimen-8-ol respecto al control (Medio MEA). Por otro lado, la actividad ligninolítica lacasa fue inhibida en todos los tratamientos. Estos datos sustentan la baja producción en los sustratos resinosos como las virutas de Pinus sp. Para complementar esta información y comprender la capacidad degradativa natural de P. ostreatus en A. araucana, se evaluó su capacidad de degradación de los lignanos presentes en la células vegetales, revelando una alta degradación de la mayoría de los compuestos, a excepción de los dos más complejos y recalcitrantes, como son el eudesmin y el secoisolariciresinol-4-metil eter-9´-acetato. El máximo de actividad lacasa en el medio de cultivo sólido a base de A. araucana fue de 0,111 ± 0,067 U/gps y el de MnP de 0,220 ± 0,109 U/gps. Se detectaron diferentes isoenzimas de lacasa con peso molecular de entre 35-41 KDa y 75-92 KDa. Los problemas productivos modificaron el foco de la investigación hacia el sustrato colonizado por las especies de Grifola como fuente de compuestos de interés.. La colonización de los sustratos utilizados (lenga, sauce y pino) fue óptima y estos cultivos se utilizaron para el análisis de la capacidad inmunomoduladora en la línea de macrófagos J774A.1 y de citotoxicidad con líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7), osteosarcoma (SAOS-2) y cáncer de colon (HCT116). En cuanto a los esteroles obtenidos el ergosterol resultó el de mayor importancia. Los ácidos grasos que se detectaron fueron ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido araquídico y ácido behénico. Los polisacáridos de G. gargal sobre madera de sauce presentaron un aumento en el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de óxido nítrico (NO) en una concentración de 50 μg.mL−1. Los efectos citotóxicos más relevantes se obtuvieron con los extractos del micelio de G. gargal y del cultivo en las diferentes maderas sobre la línea de cáncer de colon HCT116. Se realizaron ensayos específicos de degradación del azure B con los hongos de pudrición castaña Fistulina antarctica y F. endoxantha por lo observado en las placas con medio agarizado. Se observó mayor decoloración por parte del micelio, obteniéndose un máximo del 53,65% a las 96 horas.