Identificación y caracterización funcional de genes candidatos para resistencia al patógeno Sclerotinia sclerotiorum en girasol mediante análisis transcriptómico - Ehrenbolger, Guillermo Federico (2019)
La podredumbre húmeda del capítulo (PHC), ocasionada por el hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una de las enfermedades que más afectan al girasol. Si bien la resistencia cuantitativa es la única fuente para la mejora genética, la base molecular para tal resistencia es aún en gran parte desconocida. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo general el estudio de los cambios transcripcionales de líneas resistentes y susceptibles de girasol a los 0, 4 y 8 días post-inoculación con el patógeno para comprender las respuestas de defensa a S. sclerotiorum en el cultivo. Para abordar este objetivo, se plantearon distintos estudios fenotípicos, genotípicos y moleculares basados en la evaluación de seis líneas endocríadas de girasol descriptas como moderadamente resistentes y susceptibles a la PHC, en un ensayo conducido en condiciones de campo en la EEA INTA Balcarce, con inoculación artificial y muestreado a distintos tiempos post-inoculación. En la primera etapa del análisis de datos, se detectaron anomalías en el comportamiento de las líneas, por lo que resultó necesario realizar un análisis de pureza mediante marcadores moleculares SSR. De esta manera, de las seis líneas endocríadas consideradas de interés, se dispuso finalmente de materiales puros provenientes de tres de ellas: HA89, HA853 y RK416 para los posteriores análisis de detección temprana del hongo y transcriptómicos. Identificados los materiales puros, la evaluación de la incidencia, severidad, intensidad y área bajo la curva del progreso de la enfermedad, evidenció los comportamientos contrastantes de las líneas frente a la PHC. Para detectar la presencia de S. sclerotiorum previo a la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad, se evaluaron y pusieron a punto dos técnicas: una basada en observaciones ópticas y otra basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si bien ambas permitieron la detección del hongo en las plantas tratadas en los distintos tiempos post-inoculación analizados, es necesaria aún una mayor optimización de las técnicas para la obtención de resultados más consistentes en etapas tempranas del proceso de infección. Con el objetivo de investigar los cambios transcripcionales producidos durante la interacción con S. sclerotiorum, se realizó un análisis concertado de expresión génica utilizando un microarreglo de oligonucleótidos desarrollado para el girasol. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó la identificación de genes de acuerdo a distintos criterios de selección basados en tasas de cambio, p-valores, módulos de genes co-expresados y análisis multivariado. Cada uno de estos criterios logró explicar distintas magnitudes de los efectos referidos al estadio de desarrollo de las muestras y a su estado de infección. Los perfiles de expresión revelaron que la respuesta a la presencia del hongo, medida en el número de genes identificados por cada método, difirió entre las líneas resistentes y la susceptible, siendo mayor en las dos primeras con respecto a la última. Adicionalmente, gran parte de los genes detectados fueron exclusivos de cada línea, sugiriendo el despliegue de respuestas de defensa a la PHC independientes en cada una de ellas. A través de la anotación funcional de los genes se identificaron las funciones más representadas, asociadas con: el proceso de proteólisis, las señalizaciones mediadas por receptores de membrana y por Ca 2+ , el estado redox de la célula, y el control regulatorio de diversas hormonas vegetales, más precisamente de auxinas y etileno. Asimismo, se detectaron funciones de defensa propias de cada línea. Finalmente, 43 genes mostraron patrones de expresión contrastantes entre la línea resistente y la susceptible, adjudicándoseles la denominación de genes candidatos de resistencia. Los mismos permitieron identificar numerosas funciones descriptas por cumplir roles relevantes en el proceso de defensa en plantas, tales como: detección de estrés oxidativo, factores de transcripción, ubiquitinación, inhibidores de peptidasas, transportador de iones zinc de membrana, síntesis de aminoácidos y dinámica del citoesqueleto. En conclusión, los resultados de este trabajo permiten contribuir al conocimiento de los complejos mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso infeccioso del patógeno fúngico S. sclerotiorum en girasol, así como a la identificación de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo de la interacción planta-patógeno. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de las -ómicas en las distintas etapas del mejoramiento de este cultivo oleaginoso.