Identificación y caracterización de fuentes de resistencia genética a la Marchitez Anticipada causada por Verticillium dahliae en Girasol - Montecchia, Juan Francisco (2019)
En Argentina el cultivo de girasol ocupa actualmente una superficie cultivada de aproximadamente 1.7 millones de hectáreas. Siendo nuestro país el cuarto productor mundial de esta oleaginosa y el cuarto exportador al mercado mundial de su aceite. La expansión del cultivo de soja desde fines de la década del 90 ́ produjo el desplazamiento del cultivo de girasol a zonas con menor potencialidad productiva a causa de adversidades bióticas y abióticas que restringen los potenciales de rendimiento. Entre las adversidades bióticas de mayor preponderancia en Argentina, la marchitez y quebrado del tallo causada por Verticillium dahliae (Kleb.) (MV) representa una de las principales enfermedades del cultivo, principalmente por su carácter endémico y por su elevada prevalencia. Si bien el quebrado de tallos es un síntoma poco frecuente en híbridos comerciales actualmente, el marchitamiento anticipado del cultivo causa severas pérdidas de rendimiento que pueden ser elevadas en campos altamente infestados. El área endémica de la enfermedad abarca aproximadamente 1.200.000 hectáreas, entre el sur bonaerense y La Pampa, comprometiendo gran parte de la superficie total cultivada con girasol y la región donde se concentra el 70% de la producción total de la RA. La MV es una enfermedad vascular monocíclica, cuya fuente de inóculo está constituida por los microesclerocios formados por el hongo, los cuales conservan en suelo una viabilidad infectiva de 10 a 15 años, pudiendo infectar un amplio rango de hospedantes alternativos. El control químico de la enfermedad resulta ineficiente por no haber compuestos activos efectivos para su control en xilema. El manejo de la enfermedad se basa en el uso de híbridos resistentes o tolerantes y en la incorporación de cultivos no hospedantes a la rotación dentro del plan de siembras. Ante este panorama, adquiere especial relevancia por un lado la identificación de fuentes de resistencia genética a las variantes locales del patógeno y su localización genómica, y por el otro, la caracterización molecular del patógeno junto a la identificación de líneas endocriadas de girasol diferenciales a razas como base para desarrollar herramientas para el mejoramiento asistido. Estas herramientas permitirán avanzar en el desarrollo de genotipos con niveles de tolerancia/resistencia a MV que otorguen mayor estabilidad productiva. El presente plan de trabajo tiene por objetivo la caracterización molecular de las razas virulentas locales de V.dahliae y la búsqueda de fuentes de resistencia durable a la marchitez anticipada causada por el patógeno, a través de la identificación de loci para características cuantitativas complejas (QTL, del inglés Quantitative trait loci) mediante mapeo genético (MG) de una población biparental y el mapeo por asociación (MA) sobre una población no estructurada que tiene como base materiales del programa de mejoramiento de INTA. Estas poblaciones fueron caracterizadas fenotípicamente en ensayos multiambientales sobre infectarios naturales con alta carga y diversidad patogénica. En el periodo comprendido entre las campañas 2013/14 y 2017/18 se realizaron cuatro ensayos de desafío para la población biparental (140 Líneas recombinantes endocriadas) y cinco para la población de asociación (164 Líneas Endocriadas). Los ensayos fueron conducidos en el infectario natural de la EEA-INTA-Balcarce que cuenta con aislamientos de toda la región de cultivo de girasol del sur bonaerense. Alternativamente se realizaron ensayos en el infectario natural del criadero “El Cencerro” en Coronel Suárez. Las variables fenotípicas registradas fueron la incidencia y la severidad, relevadas regularmente a distintos estadios fenológicos a lo largo del ciclo del cultivo. Se emplearon modelos lineales mixtos y modelos lineales generalizados mixtos para ajustar las medias fenotípicas de los distintos genotipos para las variables estudiadas, a lo largo de la totalidad de ensayos. Paralelamente, para la caracterización molecular del patógeno se estudiaron cuatro aislamientos del cepario de la EEA-INTA Balcarce en base al reconocimiento de marcadores moleculares definidos internacionalmente como referencia para la especie y su virulencia en otros patosistemas. Ambas poblaciones de mapeo fueron genotipificadas usando la técnica de doble restricción enzimática para reducir la complejidad del genoma seguida por secuenciación de alto rendimiento. Para la población de asociación se obtuvo una matriz incompleta de más de 180 mil loci que luego de ser filtrada con criterios de calidad fue imputada mediante modelos probabilísticos para la predicción de datos faltantes, obteniéndose una matriz final completa de 18.161 mutaciones puntuales (SNP) distribuidos en los cromosomas de girasol. Las matrices completas de loci polimórficos fueron empleados para realizar estudios de estructura poblacional y desequilibrio de ligamiento y asociaciones fenotipo-genotipo. El análisis estadístico de las asociaciones se realizó usando la metodología de intervalos compuestos en MG y modelos lineales mixtos multilocus (MLMM) en MA, identificándose polimorfismos significativamente asociados con la reducción de los niveles de la enfermedad (p<0,05, corregido por comparaciones múltiples) para ambas variables. A partir de este trabajo se comprobó que las razas patogénicas locales de V. dahliae (VArg1 y VArg2) y la raza foránea E.E.U.U. son de tipo molecular raza 2 y se identificó un conjunto de seis líneas endocriadas de girasol capaces de diferenciarlas. En relación a la resistencia a la marchitez causada por Verticillium, por mapeo asociativo se identificaron 36 regiones genómicas distribuidas en 12 de los 17 cromosomas de girasol, portadoras de SNPs asociados estadísticamente a la resistencia a la enfermedad, que explicaron 5% o más de la varianza fenotípica para las variables a las que fueron asociadas. Mediante mapeo de ligamento se localizaron seis QTL, de los cuales tres coinciden con las regiones genómicas asociadas por mapeo de asociación validando la importancia de las mismas en la contribución a la resistencia a la enfermedad. Los resultados obtenidos demuestran la utilidad de la combinación de las estrategias de mapeo de QTL y de asociación para dilucidar la composición génica de caracteres complejos como el aquí estudiado. Dada la falta de estudios publicados que indaguen sobre la base genética de la resistencia a MV en girasol, el presente trabajo resulta pionero en su aproximación a la problemática y permitirá dirigir la selección de materiales de mejora a regiones cromosómicas específicas. Ello posibilitará también futuros estudios concernientes a la naturaleza y funcionalidad de los factores genéticos presentes en las regiones identificadas, así como su implicancia en mecanismos de resistencia de base amplia o raza-específica.