Análisis de variantes génicas en el gen CYP21A2 - Bruque, Carlos David (2019)
Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto de enfermedades autosómicas recesivas, en las que se encuentra afectada la esteroidogénesis adrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma grave o clásica (FC), con dos presentaciones clínicas, perdedora de sal (PS) y simple virilizante (SV), y una leve o no clásica (NC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, ubicado en 6p21.33. El mismo, se encuentra duplicado y repetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidad de secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa al alineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia de secuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayor parte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones en cada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquella que se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien las variantes más frecuentemente encontradas en los pacientes son aquellas derivadas del pseudogen, hay un número cada vez mayor de variantes que no derivan del mismo. Los avances en la secuenciación han posibilitado una gran cantidad de información genética, sin embargo, en muchos casos esta información no se encuentra claramente estructurada, y las fuentes de información, que generalmente son diferentes bases de datos, no siempre son de fácil acceso. Por otra parte, la correcta interpretación de las implicancias biológicas de las variantes encontradas es de gran interés a la hora de determinar su patogenicidad. Nuestro laboratorio ha trabajado por más de 22 años en el diagnóstico e investigación de la deficiencia en 21-hidroxilasa. En los comienzos, caracterizando la presencia de las variantes génicas más frecuentes en el gen CYP21A2 (aquellas derivadas del pseudogen), en pacientes con deficiencia de 21-hidroxilasa de nuestra población, para luego proseguir con la secuenciación completa del gen, lo que posibilitó la identificación de variantes nunca antes descriptas, tanto en regiones codificantes, como no codificantes y regulatorias. Varias de estas variantes fueron ensayadas in vitro para determinar sus efectos biológicos. Si bien ante la presencia de una variante de secuencia no descripta, los ensayos funcionales son importantes para estimar la actividad residual de la enzima, los mismos son muy costosos, requieren de equipamiento específico y de mucho tiempo para poder ser realizados. En este contexto, y gracias a los avances bioinformáticos, existe una tendencia a utilizar diferentes herramientas computacionales que permitirían la predicción del efecto biológico de una variante de secuencia. La primera parte de esta tesis doctoral consistió en la realización de un modelo predictivo específico de la 21-hidroxilasa basado en la estructura proteica, con el fin de determinar la patogenicidad de las variantes de secuencia en la región traducible del gen CYP21A2. Se obtuvo un modelo de la proteína humana basado en la cristalografía de la proteína bovina y se analizaron 343 mutantes a las cuales se las clasificó de acuerdo a su efecto biológico sobre la proteína entre aquellas asociadas al grupo Hemo, con unión a sustrato, unión a P450 Oxidoreductasa (POR), entre otros. Ciento cuarenta y siete mutantes fueron clasificadas como potencialmente asociadas a la estabilidad de la proteína. Para estas mutantes se analizó la variación de energía libre (ΔΔG) respecto de la proteína salvaje y se la correlacionó con la actividad residual in vitro. Los resultados obtenidos fueron la base para luego estimar, mediante el cálculo de ΔΔG, la actividad residual de mutantes en las cuales no se contaba con ensayos funcionales. Este mismo procedimiento se aplicó luego sobre la estructura de la proteína humana, cuya cristalografía fue publicada en el transcurso de la tesis doctoral. Asimismo, y considerando la gran cantidad de información que se encontraba dispersa en diferentes bases de datos, publicaciones científicas así como los resultados de variantes genética obtenidas en nuestro laboratorio, se compilaron y estandarizaron los datos en una base de datos especializada, no redundante, curada y en la que se pudiera establecer una clara asociación fenotipo-genotipo con el objetivo que la misma pudiera ser útil en la práctica clínica y así facilitar el diagnóstico en la deficiencia en 21-hidroxilasa. Esta base unificada contiene los datos de 899 variantes del gen CYP21A2, de las cuales para 230 fue posible establecer una correlación con diferentes formas de presentación de la patología. La segunda parte de la tesis consistió en la realización de ensayos in vitro de una de las regiones regulatorias de la transcripción del gen, denominada promotor Z (PZ). En trabajos previos de nuestro laboratorio se describió la presencia de una variante de secuencia g.32033649A>G (GRCh38.p7) en esta región que causa una disminución de la tasa transcripcional del gen CYP21A2. Mediante análisis bioinformático se predijo que esta variante podría estar generando una nueva interacción con el receptor de glucocorticoides (GR). Estas predicciones resultaban muy novedosas, ya que no se había descripto hasta el momento que el GR pudiera modular la expresión del CYP21A2. A los efectos de comprobar la posible participación del GR y el mecanismo molecular por el cual la variante hallada reducía la transcripción del gen, se realizaron ensayos de estimulación de la transcripción en presencia de dexametasona y cortisol, en líneas celulares esteroidogénicas que fueron transfectadas con un vector con la versión salvaje o mutada del PZ río arriba del gen luciferasa. Estos ensayos se complementaron con el análisis de la expresión endógena del mensajero en las mismas células (sin los vectores) y con los estímulos mencionados. Los resultados obtenidos, si bien son preliminares, no estarían indicando que la región del PZ se module en presencia de GR. Sin embargo, se observó que la expresión del gen endógeno variaba en presencia de los estímulos, lo que indicaría que no se puede descartar que el GR pudiera modular la expresión del CYP21A2. En conclusión, en esta tesis se generó un modelo predictivo específico basado en la estructura proteica para la 21 hidroxilasa, se desarrolló una base de datos de variantes génicas integral con información de correlación genotipo-fenotipo y se avanzó en la comprensión de los elementos regulatorios implicados en la expresión del gen CYP21A2.